高灵敏靶标自环化滚环扩增检测的动态接头构建❋

王晨儒，安 然，2❋❋，梁兴国，2

(1．中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003； 2．青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋药物与生物制品功能实验室，山东 青岛 266237)

滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)是指以环状DNA为扩增模板，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下，扩增产生具有重复序列长链DNA的一种等温扩增技术[1-2]。RCA具有等温反应、扩增效率高、可进行原位扩增和易与其他技术联合等优势，适合应用于微生物的现场检测和高通量初筛[3-4]。近年来，随着RCA技术的快速发展，研究者们已开发了针对miRNA[5-6]、病原菌[7-8]、蛋白质[9-10]、毒素[11]甚至重金属[12-13]等多种物质的RCA检测技术。此外，RCA还被用于DNA纳米结构的构建、药物载体的制备[14-16]和生化分析等领域[17-19]。

为使RCA可检测线性DNA靶标，大多RCA技术通过锁式探针将线性靶标转化为环状模板。锁式探针两端分别与靶标片段互补配对，并在靶标的辅助下环化，然后DNA聚合酶以环化的锁式探针为模板进行扩增[3,8]。然而，这种方法的实质是对人为加入的锁式探针进行扩增，并非真正扩增靶标片段，因此存在特异性较差、假阳性率高等问题。针对此问题，Wang等[18,20]建立了一种将靶标环化的新型RCA技术，称为靶标自环化滚环扩增(Target-circularization RCA，TC-RCA)。具体原理是通过IIS型限制性内切酶(产生随机黏性末端)切割目标基因，产生两端具有不同黏性末端的靶标片段；再利用可与靶标黏性末端互补配对的特异性接头(两条部分互补的单链DNA杂交形成的带有黏性末端的接头)捕获靶标片段，并在连接酶的作用下使靶标环化为带有缺口(Gap)的双链环状DNA；……