大豆脲酶诱导碳酸钙沉淀的多因素影响分析

原 华，刘 康，原耀楠，冯佳星

(1.河南大学，岩土与轨道交通工程研究所，开封 475004；2.河南大学土木建筑学院，开封 475004；3.河南建业置地焦作有限公司，焦作 454150；4.北京中科宏泰顾问集团有限公司，北京 101100)

0 引 言

微生物矿化是自然界中一种广泛存在的现象。随着人们对生态环境保护力度加大，各行业都在追寻绿色环保技术，实现可持续发展。近年来在岩土工程领域，微生物诱导碳酸钙沉淀(microbial induced carbonate precipitation，MICP)成为一项新兴的土体矿化技术。事实上，除微生物外，脲酶广泛存在于植物(如豆类、瓜类[1]等)中，国外学者基于MICP又提出脲酶诱导碳酸钙沉淀(enzyme induced carbonate precipitation，EICP)技术[2]。

脲酶主要有三种来源：(1)通过培养产脲酶细菌，经离心获取脲酶。但这种脲酶活性不稳定，且细菌培养步骤复杂，周期较长，不适合用来大量获取脲酶。(2)商品化脲酶，主要从洋刀豆中提取的高纯度脲酶。虽然活性较高，但价格昂贵，难以大规模使用。(3)从植物中获取脲酶，尤其是豆类中，富含大量脲酶。在我国，大豆作为产量最高的豆类，价格实惠，最符合作为稳定的脲酶来源，而大豆脲酶粗提液获取简单便捷，能够有效降低成本。尽管现有研究已表明：在大豆脲酶诱导碳酸钙沉淀(soybean urease-induced calcium carbonate precipitation，SICP)[3]的过程中脲酶活性、温度[4]、pH值[5]、Ca2+浓度[6]、尿素浓度等均会影响钙离子的矿化。但这些研究大多仅对其中某单一因素的影响进行分析，对SICP多因素影响的研究尚未见诸报道，且未能优选出各个因素的最佳取值范围。

本文从市售大豆中提取脲酶，探究脲酶浓度和温度对脲酶活性的影响；并通过正交实验设计，分析不同脲酶浓度、脲酶和胶结液体积比、Ca2+浓度、温度、pH值等多种因素对SICP的影响；并借助扫描电子显微镜(SEM)观察不同因素下生成碳酸钙的形态。

1 实 验

1.1 实验材料

反应液由脲酶溶液和胶结液组成，胶结液包括氯化钙(CaCl2)和尿素(urea)。脲酶从大豆中提取，具体提取方法如下[7]：(1)将大豆粉碎烘干，然后过0.25 mm筛，所得豆粉置于低温干燥烘箱内保存；(2)将一定质量的豆粉与去离子水按一定比例混合后，放置在电磁搅拌器上搅拌30 min，所得豆粉溶液放入5 ℃冰箱内静置2 h；(3)将豆粉溶液以3 000 r/min的速度离心15 min，随后用土工布过滤残渣，此时所得溶液即为大豆脲酶粗提液。将该溶液在5 ℃低温环境下储藏，随用随取。CaCl2、urea及调节pH值所需的氢氧化钠(NaOH)、无机酸等化学试剂购买于天津大茂化学试剂厂。去离子水由实验室制备。

1.2 实验设计

首先研究脲酶浓度和实验温度对脲酶活性的影响；之后选择脲酶浓度C1、脲酶和胶结液体积比BV、CaCl2和urea浓度比BC、Ca2+浓度C2、温度T、pH值为实验因素，进行6因素5水平正交设计(共25种工况)，分析每种工况下的Ca2+利用率，揭示不同因素对碳酸钙矿化率的影响。实验原理见式(1)、(2)。

(1)

(2)

1.3 实验方法

正交实验中每种工况的步骤如下：(1)根据表1中C2、BC的值计算CaCl2和urea的质量，配置胶结液，并用稀释NaOH和无机酸溶液对其pH值进行调节；(2)配置实验工况所需浓度的脲酶溶液并调节其pH值；(3)根据BV推算所需胶结液和脲酶溶液的体积(反应液总体积为40 mL)，用移液枪取样并将两者在试管中混合均匀；(4)反应液在设定温度下发生矿化反应，用EDTA滴定法[9]测定不同时刻溶液中Ca2+浓度，以此计算Ca2+利用率，该指标反映出碳酸钙的沉淀效率[10]。每种工况3个平行试样，共75个试样。生成的碳酸钙沉淀置于60 ℃烘箱中干燥24 h后，借助SEM观察碳酸钙形态。

2 结果与讨论

2.1 脲酶活性

不同脲酶浓度和温度下脲酶活性随时间的变化如图1所示。相同温度下，脲酶浓度越大，脲酶初始活性越高。100 g/L脲酶的初始活性高达19.5 mmol·min-1，之后随着尿素水解反应的进行，脲酶活性持续降低，24 h时脲酶活性不足4 mmol·min-1。脲酶浓度相同时，环境温度越高脲酶失活越快，说明高温不适宜脲酶的储存(见图1(a))。5 ℃时不同浓度的脲酶均可在较长时间内(21 d以上)保持一定活性，同一温度脲酶浓度越高，脲酶完全丧失活性的时间越短(见图1(b))。

图1 不同温度下的脲酶活性随时间的变化曲线Fig.1 Curves of urease activity with time at different temperatures

2.2 Ca2+利用率

每种工况3次平行实验的Ca2+利用率平均值如表1所示。借助正交实验直观分析法研究各因素对Ca2+利用率的影响，用Ai、Di和R(i=1、2、3、4、5)分别表示所有工况中该列因素取水平i值时，所对应Ca2+利用率之和、Ca2+利用率平均值和极差(最大值与最小值之差)。如C1列A2表示工况ZJ6至ZJ10的Ca2+利用率之和。3个正交分析的参数也列于表1。各因素对应的极差大小关系为pH值>BV>C2>C1>T>BC，pH值和BV对应的极差远大于其他因素，说明pH值和BV是影响SICP矿化的主因。

表1中各因素所对应Ca2+利用率平均值随因素值的变化如图2所示。随着脲酶浓度的提高，Ca2+利用率持续增大；脲酶和胶结液体积比达到1后，Ca2+利用率反而随脲酶掺量的增大而减小，说明此时脲酶掺量不再是影响矿化的主要因素(见图2(a))。CaCl2与urea浓度比为1.5时，Ca2+利用率最高；Ca2+浓度超过1 mol/L后Ca2+利用率陡降。这是由于过高浓度的Ca2+抑制脲酶活性，削弱脲酶催化作用，降低尿素水解能力[11](见图2(b))。pH值为8时，Ca2+利用率达到峰值79.6%，说明弱碱性环境有利于碳酸钙矿化；尽管温度对Ca2+利用率的影响较弱，但仍能清晰看到Ca2+利用率随温度的升高而增大(见图2(c))。

2.3 碳酸钙的外貌形态

图3显示了不同工况下生成碳酸钙的微观形态。当脲酶浓度过低时(ZJ1、ZJ2、ZJ3)除生成球形碳酸钙外，局部尚有六面体形碳酸钙形成；但脲酶浓度增大后，碳酸钙形态逐渐演变为球形(ZJ5、ZJ15、ZJ25)。即随着脲酶中天冬氨酸(Asp)浓度提高，生成的碳酸钙逐渐向球形转变[12]。其他学者也曾发现大豆中富含的Asp等物质是控制碳酸盐结构成核、生长的重要因素[13-14]，并利用提纯Asp诱导生成球霰石。因此，可以认为碳酸钙形态的转变与豆液脲酶中富含的Asp有关。这是由于碳酸钙晶体形状取决于晶面数量。当溶液中Asp浓度较高时，其羧基先与Ca2+螯合，使Ca2+形成12配位数的空间结构即球形碳酸钙晶核，之后通过离子交换反应生成球形碳酸钙[15]。球形碳酸钙因具有比表面积大、分散流动性好等优点，在造纸、电子、塑料、油墨等领域应用广泛[16-17]。

表1 不同因素下Ca2+利用率Table 1 Ca2+ utilization ratio at different factors

图2 不同因素对钙离子利用率平均值的影响Fig.2 Influence of different factors on the average value of Ca2+ utilization ratio

图3 不同工况下生成碳酸钙的SEM照片Fig.3 SEM images of calcium carbonate formed under different working conditions

3 结 论

(1)高温不利于脲酶保存及脲酶活性的发挥，5 ℃下脲酶活性可保持21 d以上；相同温度下，脲酶浓度越大，脲酶初始活性越高，脲酶完全丧失活性的时间越短。

(2)大豆脲酶诱导碳酸钙沉淀过程中，反应液pH值、脲酶与胶结液体积比为影响Ca2+利用率的主要因素。Ca2+利用率随脲酶浓度的增大而持续上升。为实现较高的Ca2+利用率，脲酶和胶结液最佳体积比为1，CaCl2与urea最优浓度比为1.5，Ca2+最佳浓度为1 mol/L。反应液pH值宜控制在中性或弱碱性；温度和Ca2+利用率之间呈正相关变化，但提升幅度较小；Ca2+浓度过高时会抑制脲酶活性。

(3)豆液中富含的Asp是控制碳酸钙外貌形态的重要因素，随着脲酶浓度的增大，生成的碳酸钙逐渐由六面体状向球形转变。本研究中大豆脲酶诱导生成的碳酸钙多为球形，为借助生物矿化诱导生成球形碳酸钙提供了新思路。