槐白皮提取物治疗口腔溃疡大鼠的效果及对炎症因子的影响

张国淼 苏成宇 俞洁 谢雨欣 张美琪 官杰

【摘要】 目的：探討槐白皮提取物对口腔溃疡大鼠的治疗效果及作用机制。方法：雄性SD大鼠54只，适应性饲养7 d后随机抽取9只作为正常组，其余大鼠制作口腔溃疡模型后随机分为模型组、槐白皮提取物低、中、高浓度组和左旋咪唑组。正常组、模型组给予生理盐水，槐白皮提取物低、中、高浓度组分别给予槐白皮提取物（20、35、50 mg/mL），左旋咪唑组给予左旋咪唑（2 mg/mL），连续灌胃给药7 d，1次/d，2 mL/次。分别在给药第1、3、7天记录各组大鼠口腔溃疡充血程度、感染程度和最大横径、最大纵径，计算溃疡面积;实验结束后每组各取一只大鼠黏膜组织HE染色观察组织形态学变化;ELISA法检测大鼠血清中IL-17、IL-18、IL-35、IL-37水平并测量大鼠脾系数。结果：给药第1、3、5、7天，其余造模各组口腔溃疡面积与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;给药第7天，槐白皮提取物高浓度组口腔溃疡面积与给药第1天比减小（P<0.05）;给药第7天，与模型组比较，左旋咪唑组溃疡表面感染程度减轻、槐白皮提取物低浓度组溃疡充血程度减轻（P<0.05）;模型组病理切片可见大量炎细胞浸润，槐白皮提取物低、中、高浓度组、左旋咪唑组均出现不同程度修复;与模型组比较，槐白皮提取物中、高浓度组大鼠血清IL-17、IL-18水平均降低，槐白皮提取物低、中、高浓度组IL-35水平均升高（P<0.05）;各组IL-37水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：槐白皮提取物可减轻大鼠口腔溃疡充血程度，加速愈合，对大鼠口腔溃疡有治疗效果，机制可能与降低炎症反应中的IL-17、IL-18水平，提高IL-35水平，调节大鼠免疫功能有关。

【关键词】 槐白皮提取物 口腔溃疡 大鼠 IL-17 IL-18 IL-35 IL-37

Effect of Sophora Japonica Water Extract in the Treatment of Rats with Oral Ulcers and Its Influence on Inflammatory Factors/ZHANG Guomiao， SU Chengyu， YU Jie， XIE Yuxin， ZHANG Meiqi， GUAN Jie. //Medical Innovation of China， 2021， 18（34）： 0-019

[Abstract] Objective： To investigate the therapeutic effect and mechanism of Sophora Japonica Water Extract on rats with oral ulcers. Method： After 7 d of adaptive-feeding， nine of fifty-four male SD rats were randomly selected as the normal group， the other rats were randomly divided into the model group， low， medium and the high concentration of Sophora Japonica Water groups and Levamisole group after making oral ulcer model. The normal and model groups were given normal saline， while the low， medium and high concentration of Sophora Japonica Water groups were given 20， 35， 50 mg/mL of Sophora Japonica Water Extract respectively， the Levamisole group was given 2 mg/mL of Levamisole， intragastric administration continued with 2 mL per day for 7 d. The degree of oral ulcer congestion， infection and the maximum transverse and maximum longitudinal diameters of rats in each group were recorded on the 1st， 3rd and 7th day， respectively to calculate the ulcer area. Histomorphological changes were observed by HE staining of mucosal tissue obtained from one rat in each group at the end of the experiment. The levels of serum IL-17， IL-18， IL-35， and IL-37 were measured by ELISA and the rat spleen coefficient was measured. Result： On the 1st， 3rd， 5th and 7th day of administration， there were no significant differences in the area of oral ulcers in the remaining groups with ulcers compared to the model group （P>0.05）. On the 7th day of administration， the oral ulcer area was reduced in the high concentration of Sophora Japonica Water Extract group compared to the 1st day of administration （P<0.05）. At the same time compared with the model group， the extent of ulcer surface infection was reduced in the Levamisole group， the extent of ulcer congestion was reduced in the low concentration of Sophora Japonica Water Extract group （P<0.05）. The pathological sections of the model group showed a large number of inflammatory cell infiltration， which was restored to different degrees in the low， medium and high concentration of Sophora Japonica Water Extract groups and the Levamisole group. Compared with the model group， the levels of IL-17 and IL-18 in the serum of rats in the middle and high concentration of Sophora Japonica Water Extract groups decreased， while the levels of IL-35 in the low， middle and high concentration of Sophora Japonica Water Extract groups increased （P<0.05）. There was no significant difference in IL-37 levels among the groups （P>0.05）. Conclusion： Sophora Japonica Water Extract can reduce the area， decrease the extent of congestion， and accelerate healing of oral ulcers in rats， and the mechanism may be related to reducing the levels of IL-17 and IL-18 in inflammatory response， increasing the levels of IL-35， and regulating the immune function of rats.

[Key words] Sophora Japonica Water Extract Oral ulcer Rats IL-17 IL-18 IL-35 IL-37

First-author’s address： School of Stomatology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.34.004

口腔潰疡是一种常见的溃疡性损伤疾病，主要临床表现为周期复发性口腔黏膜溃疡，可有明显疼痛、烧灼感及口干，直接影响患者日常活动[1]。研究表明，口腔溃疡的发生与自身免疫相关，血清细胞因子及免疫系统在口腔溃疡中的作用及机制目前尚在探索[2-3]。口腔溃疡目前主要以消除病因、增强体质、对症治疗为主，临床中有较多利用中草药治疗口腔黏膜疾病的范例[4]。中医古籍《圣惠方》曾记载槐白皮治疗热病口疮，相关文献表明槐白皮水提物可以促进家兔口腔创伤愈合、提高免疫抑制小鼠的免疫功能，提示其适用于口腔溃疡的治疗[5]。本项研究建立动物口腔溃疡模型，通过实验探究槐白皮对口腔溃疡大鼠炎症细胞因子的作用机制，为槐白皮临床应用及口腔溃疡治疗提供实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠54只，220～260 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，合格证号SCXK（辽）2020-0001，实验操作符合医学院动物伦理委员会要求。

1.2 药品和试剂 槐白皮原料200 g，购自山皇草集神农架山区;冰醋酸（天津市凯通化学试剂有限公司20190712）、水合氯醛（天津市凯通化学试剂有限公司20190326）均购自龙沙区贝迪科教实验用品经销处;ELISA试剂盒：白细胞介素-17（IL-17）（批号：20201223225）、白细胞介素-18（IL-18）（批号：20201223185）、白细胞介素-35（IL-35）（批号：20201223136）、白细胞介素-37（IL-37）（批号：20201223521）均购自厦门慧嘉生物科技有限公司。

1.3 仪器 酶标仪（Labsystems Multiskan MS 352型，芬兰）、洗板机（Thermo Labsystems AC8，芬兰热电）、微量高速离心机（湘仪集团TG16W，中国）、隔水式恒温培养箱（上海精宏GNP-9080型，中国）。

1.4 药物制备

1.4.1 槐白皮提取物的制备 200 g槐白皮加1.4 L水，90 min后浓缩至800 mL，1.05 L水倒入锅中继续浓缩90 min至600 mL，最后再加入800 mL，浓缩至1 L，即可得到200 mg/mL的槐白皮提取物，-20 ℃保存[5]。200 mg/mL的槐白皮提取物分别稀释至20、35、50 mg/mL的溶液，4 ℃冷藏，现用现配。

1.4.2 左旋咪唑的配置 左旋咪唑片用双蒸馏水稀释2 mg/mL的左旋咪唑溶液，现用现配[6]。

1.5 动物模型制备 54只雄性SD大鼠，随机数字表法抽取9只作为正常组，不做处理，其余大鼠以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后，将3 mm×3 mm正方形滤纸片置于50%浓度冰醋酸5 s后，放置于大鼠下切牙唇侧黏膜30 s，24 h后观察大鼠口腔黏膜形成溃疡，与正常组比较各组口腔溃疡创面明显，即模型建立成功[7]。

1.6 动物分组及给药 造模成功后45只大鼠随机数表法分为模型组、槐白皮提取物低、中、高浓度组、左旋咪唑组。各组连续给药：正常组、模型组分别给予0.9%氯化钠注射液2 mL灌胃，1次/d;槐白皮提取物低、中、高浓度组分别给予20、35、50 mg/mL槐白皮水提物共2 mL灌胃，1次/d;左旋咪唑组给予2 mg/mL左旋咪唑溶液2 mL灌胃，1次/d。连续给药7 d后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后固定于操作台上，腹主动脉取血，在4 ℃下2 500 r/min离心15 min，取上层血清，于-80 ℃贮存、待用。

1.7 观察指标与判定标准

1.7.1 溃疡情况 （1）溃疡面积测定：在24 h建模成功后分别在给药第1、3和7天进行大体观察，用游标卡尺测量溃疡最大横径（D1）、最大纵径（D2），计算溃疡面积=0.25×π×D1×D2，π=3.14[8]。（2）溃疡表面感染情况：Ⅰ度为表面无明显假膜;Ⅱ度为溃疡表面有薄层黄白色假膜，周围无水肿;Ⅲ度为溃疡表面假膜较厚，且周围伴有炎性水肿[9]。（3）溃疡周围充血程度：Ⅰ度为充血直径<1 mm，Ⅱ度为充血直径1～2 mm，Ⅲ度为充血直径>2 mm但不超过4 mm，Ⅳ度为充血直径>4 mm。

1.7.2 组织病理学 实验结束，取每组一只大鼠右侧颊部溃疡处黏膜组织，于4%甲醛中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察其组织病理学变化。

1.7.3 细胞因子及免疫器官指数 采用ELISA法测定大鼠血清中IL-17、IL-18、IL-35、IL-37含量，严格按照试剂盒说明书操作;处死大鼠，打开腹腔取出脾脏，去除血液并用滤纸拭干，称重并记录。脾系数=脾脏质量（mg）/体质量（g）。

1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组方差齐时，用最小显著法检验进行多组均数间两两比较;非正态分布计量资料用M（P25，P75）表示，使用非参数检验进行分析，使用Kruskal-Wallis检验进行多组间两两比较，使用两配对样本的Wilcoxon符号秩检验进行各组自身前后对照;等级资料采用Ridit检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槐白皮提取物对口腔溃疡大鼠口腔溃疡指标的影响

2.1.1 槐白皮提取物对大鼠口腔溃疡面积的影

响 给药第1天，与正常组相比，其他组大鼠口腔溃疡面积增加，差异均有统计学意义（P<0.05）;但给药第3、7天，槐白皮提取物高浓度组口腔溃疡面积与正常组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;给药第1、3、5、7天，模型组、槐白皮提取物低、中、高浓度组及左旋咪唑组两两口腔溃疡面积比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;槐白皮提取物低浓度组给药第3天口腔溃疡面积大于给药第1天，槐白皮提取物高浓度组给药第7天口腔溃疡面积小于给药第1天，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.1.2 槐白皮提取物对冰醋酸口腔溃疡感染程度的影响 采用Ridit检验，五组给药第1、3、5天口腔溃疡表面感染情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;五组给药第7天口腔溃疡表面感染情况比较，差异有统计學意义（P<0.05），左旋咪唑组口腔溃疡表面感染程度轻于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.1.3 槐白皮提取物对冰醋酸口腔溃疡充血程度的影响 采用Ridit检验，五组给药第1、3、5天口腔溃疡充血程度比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;五组给药第7天口腔溃疡充血程度比较，差异有统计学意义（P<0.05），槐白皮提取物低浓度组溃疡充血程度轻于模型组（P<0.05）。见表3。

2.2 槐白皮提取物对口腔溃疡大鼠组织病理形态学的影响 给药7 d后将大鼠处死，取各组大鼠溃疡的黏膜组织显微镜下观察其病理变化。正常组：可以见到大鼠口腔黏膜组织层结构完整清晰，无炎细胞浸润（图1a）;模型组：可见大鼠口腔黏膜破坏，鳞状上皮脱落，细胞排列紊乱，出现大量炎症细胞（图1b）;槐白皮提取物低浓度组：可见大鼠口腔黏膜上皮组织愈合，可见大部分组织被肉芽组织代替（图1c）;槐白皮提取物中浓度组：可见大鼠口腔黏膜上皮组织愈合良好，部分组织被新生的胶原纤维覆盖（图1d）;槐白皮提取物高浓度组：可见大鼠口腔黏膜上皮基本愈合，黏膜下层有胶原纤维组织包裹，并有少量瘢痕组织形成，有少量中性粒细胞浸润（图1e）;左旋咪唑组：可见大鼠口腔黏膜上皮基本愈合，黏膜下层有瘢痕组织包裹，有少量中性粒细胞浸润（图1f）。

2.3 槐白皮提取物对口腔溃疡大鼠血清中细胞因子及脾系数的影响 与正常组比较，模型组血清IL-17、IL-18水平均升高，IL-35水平明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，槐白皮提取物低浓度组血清IL-17、IL-18水平均降低、IL-35水平上升，槐白皮提取物中浓度组IL-35水平上升，槐白皮提取物高浓度组IL-17水平降低、IL-35水平上升，差异均有统计学意义（P<0.05）;与槐白皮提取物低浓度组比较，槐白皮提取物中、高浓度组和左旋咪唑组血清IL-18水平均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;六组血清IL-37水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组相比，槐白皮提取物低、中、高浓度组和左旋咪唑组脾系数均增大，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

作为常见、多发的口腔黏膜疾病，口腔溃疡成因复杂，病因尚不明确[10]。在口腔溃疡发病因素中，免疫因素占有重要地位，一般认为免疫功能紊乱使促炎因子与抑炎因子分泌失衡导致了炎症反应的发生[11]。槐白皮系豆科植物，含有山槐素、氧化苦参碱等活性成分，具有降压抗菌、调节免疫等作用[12]。

本实验建立口腔溃疡模型，观察发现槐白皮提取物对口腔溃疡大鼠的临床症状、口腔黏膜病理损伤具有改善作用，但不同浓度的槐白皮提取物对口腔溃疡大鼠临床症状改善情况不同。本实验没有充分证据说明槐白皮提取物对口腔溃疡面积减小的作用，可能与面积数据测量难度有关，也可能与溃疡愈合的过程有关，槐白皮提取物对口腔溃疡面积具体作用有待进一步研究;槐白皮提取物对大鼠口腔感染程度未见明显改善，对槐白皮提取物的抑菌作用有待进一步实验探究;低浓度的槐白皮提取物能改善大鼠口腔的充血情况;槐白皮提取物也有利于溃疡组织的修复和愈合，具体机制有待进一步研究。

IL-17和IL-18均为促炎细胞因子。IL-17是新发现的主要由Th17细胞、单核细胞等分泌的一种促炎症细胞因子[13]。近年来研究发现，IL-17可通过IL-17RA或IL-17RE受体刺激口腔角质细胞，在复发性阿弗他溃疡中产生促炎作用[14]。IL-18主要介导细胞免疫反应，显著增加Th1型免疫反应[15]。IL-18在口腔疾病中可出现异常表达，可能与口腔相关炎症性疾病的发病密切相关[16]。本实验结果显示，低浓度槐白皮提取物可显著降低大鼠血清中IL-17、IL-18水平，高浓度槐白皮提取物可显著降低大鼠血清中IL-17水平，提示槐白皮提取物可能通过降低血清促炎因子水平抑制口腔溃疡炎症反应，加速愈合。槐白皮提取物高浓度组血清IL-17水平同样显著降低，但不如槐白皮提取物低浓度组降低的程度明显，提示槐白皮提取物对IL-17、IL-18的作用可能与剂量有关。

IL-35被誉为最强抗炎因子，现有研究表明IL-35信号通路相关因子可能在口腔扁平苔癣、牙周炎的免疫发病机制中起一定作用，但在口腔溃疡中的作用尚不明确[17-19]。本实验低、中、高浓度槐白皮提取物均显著提高IL-35水平，提示槐白皮可以通过提高抗炎细胞因子水平以达到抑制炎症的作用。有研究报道，IL-37在慢性牙周炎患者牙周基础治疗后的龈沟液中浓度明显提高，提示IL-37在牙周炎的发生发展过程中起一定作用[20]。但本实验结果显示，各组血清IL-37水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。提示血清IL-37水平在口腔溃疡的炎症反应中可能无直接意义。脾脏作为淋巴细胞接受抗原刺激并产生免疫反应的中心，脾系数能够很好地反映免疫系统的功能状态[21]。本实验中槐白皮低、中、高浓度组和左旋咪唑组的脾系数均增高，提示低、中、高三种浓度的槐白皮提取物均可通过影响免疫器官和免疫细胞来提高机体免疫功能。

综上所述，免疫功能紊乱与口腔溃疡的形成密切相关，槐白皮提取物可显著降低口腔溃疡模型大鼠的溃疡充血程度，加速溃疡面愈合，是一种有效的治疗口腔溃疡的药物，其机制可能与降低炎症反应中的促炎因子IL-17、IL-18水平，提高抑炎因子IL-35水平、调节口腔溃疡大鼠的免疫功能有关。

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（收稿日期：2021-09-03）

基金项目：黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（202011230030）

①齐齐哈尔医学院口腔医学院 黑龙江 齐齐哈尔 161000

②齐齐哈尔医学院精神卫生学院

③齐齐哈尔医学院医学技术学院

通信作者：官杰