利用CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的B16细胞株

刘孟雨，周雅博，黄 波，吕家迪

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 免疫学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

近几年人们在黑色素瘤(melanoma)免疫治疗和靶向治疗方面取得了一定的进展，提高了转移性黑色素瘤患者的生存率[1-2]。但有研究发现在黑色素瘤细胞中过表达含E1的休克域(cold shock domain containing E1，CSDE1)能够促进肿瘤侵袭和转移[3]。CSDE1属于一种RNA结合蛋白(RNA binging proteins,RBP)，主要在细胞质中表达，能够结合单链DNA和RNA，在基因转录和转录后调控过程发挥着关键作用[4-6]。

基因编辑技术中以Cas9应用最为广泛，这项技术已用于基因治疗领域[7]。但在基因编辑过程中由于非同源末端连接修复容易出错以及同源重组的频率变化等问题，使得其不能适用于每一种生物体细胞[8]。因此本实验采用了Sakuma T实验室改进的新型CRISPR/PITCH(clustered regularly inters-persed short palindromic repeats-precise integration into target chromosome，CRISPR/PITCH)系统进行基因敲入，通过一段非常短的同源序列(5～25 bp)，将供体载体上目的片段EGFP精确敲入到CSDE1中，构建出稳定表达CSDE1-EGFP的细胞株。相比之下CRISPR/PITCH系统具有更高效、更简洁、更可控的优势，为以后在科学研究、临床治疗中的应用提供了更加方便的可能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与质粒:黑色素瘤细胞系B16购自于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；雌性8周龄C57小鼠购自于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心。Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)；质粒PX330A-1×2、PX330S-2-PITCH、pCRISPR-PITCH(v2)-FB(Addgene公司)。

1.1.2 试剂:BsaⅠ-HFv2、NheⅠ-HF、SpeⅠ-HF、10×酶切缓冲液和T4连接酶(New England Biolabs公司)；Fast DigestBpiⅠ内切酶、Opti-MEMI培养基和10×酶切缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)；无内毒素质粒大提试剂盒和琼脂糖回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、基因组提取试剂盒(康为世纪生物技术有限公司)；……