基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺

王嘉琪，董育红，姜菊玲，钱建宁，魏文涛，宋国亮，焦金波，关新新，姬郭彪，张业炘

基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺

1甘肃健顺生物科技有限公司，兰州 730070；2洛阳惠中生物技术有限公司，河南洛阳 471000

【】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株，摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间），为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板，每2 d观察细胞生长和形态，待细胞90%长满后，将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板，最后到方瓶，筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×106细胞/mL的密度，直接接种在PK15的无血清培养基中，并置于37℃，5%二氧化碳，120 r/min的摇床培养箱中继续培养，每天监测细胞密度和活率，每3 d传代，使细胞逐渐适应悬浮环境，驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株；细胞传代稳定并建库后，接种PCV2病毒，通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异，筛选1株克隆细胞，用于生产PCV2；针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞），摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h），确定PCV2最佳生产工艺。（1）贴壁细胞置于无血清培养基中，适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长，连续传至11代，细胞生长稳定，按照1×106/mL接种细胞，细胞生长72h时细胞密度可达到10×106/mL，活率在95%以上，倍增时间为20h左右；（2）3株悬浮细胞使用相同条件，分别接种PCV2病毒后，PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到106.4TCID50/mL，克隆PK15-2F11（105.5TCID50/mL）、PK15-1E5（105.6TCID50/mL），3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（104.7TCID50/mL），但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定，确定为后续研究用细胞；……