人冠状病毒抗体依赖增强作用的研究进展

袁梦娇，虞 倩，王蓓丽，潘柏申，郭 玮

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

冠状病毒是一种有包膜无节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，根据其系统发育和基因结构分为4个属——α、β、γ和δ[1]。2002年、2012年在全球范围内流行的严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）均可引起严重的呼吸系统疾病[2]。2019年年底出现的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[3]是继SARSr-CoV、 MERSr-CoV后从野生宿主跨种系感染人类的第3种可引起严重呼吸系统疾病的人类冠状病毒[4]。SARSr-CoV、MERSr-CoV和SARS-CoV-2同属冠状病毒β属[5]。SARS-CoV-2与SARSr-CoV、MERSr-CoV的同源性分别为79.5%、51.8%[5]。目前，针对SARSr-CoV、MERSr-CoV及SARS-CoV-2感染尚无特效治疗方案[6]。研制安全、有效的疫苗，开展人群，特别是高危人群免疫接种是较好的防控措施之一。

病毒入侵后，机体会产生特异性中和抗体，抑制病毒感染细胞，但在特定情况下，抗体反而起到促进病毒感染细胞的作用，这一现象被称为抗体依赖性增强作用（antibodydependent enhancement，ADE）。ADE存在于多种病毒感染过程中，如登革病毒、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、流感病毒、埃博拉病毒等[7-8]，在冠状病毒感染中也有发现，如SARSr-CoV、MERSr-CoV、猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV）等[9-10]。鉴于抗体在宿主免疫中的重要作用，ADE在疫苗设计、研发等方面的作用引起了学者们的广泛关注。使用常规疫苗免疫来防治具有ADE作用的病毒常常难以奏效，甚至会诱发疾病进展。ADE是病毒持续性感染、机体免疫失败及疫苗效果不佳的重要原因，亦是人冠状病毒至今无有效疫苗的关键障碍。本文综述了人冠状病毒抗体诱导病毒感染，增强细胞易感性或异常病毒致病的ADE机制，为疫苗设计、抗体相关药物及免疫治疗等提供一定的理论依据。

1 冠状病毒的ADE现象

ADE最早由HAWKES[11]在20世纪60年代报道，此类研究多见于登革病毒、HIV、埃博拉病毒等[7-8]。冠状病毒的ADE现象是在1981年被WEISS等[12]报道的。1990年，科学家采用表达FIPV包膜蛋白的重组牛痘病毒免疫猫，产生的特异性抗体增强了FIPV感染巨噬细胞的能力，导致了严重的猫传染性腹膜炎[10]。后续研究证实，用冠状病毒包膜蛋白可免疫诱导针对动物冠状病毒的保护性抗体[13]，这种抗体在特定情况下也可增强病毒的感染能力，导致冠状病毒感染性疾病恶化[14]。

人冠状病毒包膜主要由3种结构蛋白[核膜（membrane，M）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白和棘突（spike，S）蛋白]组成。S蛋白在介导病毒与宿主细胞表面受体结合、触发病毒包膜与细胞质膜或包涵体膜融合、诱导机体产生中和性抗体及诱导细胞间融合方面起关键作用[15]。血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是SARS-CoV-2和SARSr-CoV S蛋白的功能性受体，主要参与调节肾素-血管紧张素系统，对急性肺损伤、肺动脉高压具有保护作用。SARS-CoV-2和SARSr-CoV S蛋白受体结合域与ACE2高效结合，诱导S蛋白构象发生变化，启动膜融合，介导SARS-CoV-2进入宿主细胞[16]。

YIP等[17]发现针对SARSr-CoV的S蛋白靶抗原的纯化IgG抗体促进了SARSr-CoV及S蛋白假病毒慢病毒颗粒（severe acute respiratory syndrome pseudotype particles，SARSr-CoVpp）感染人单核细胞来源的巨噬细胞。LIU等[18]使用重组安卡拉株对照疫苗和表达SARSr-CoV S蛋白的疫苗免疫接种猕猴，用SARSr-CoV鼻腔攻毒后进行取血检测中和抗体效价、病毒载量，并进行病理学检查，结果显示接种疫苗后，S蛋白免疫组血清第2周即产生高滴度的中和性抗体，且持续存在至攻毒后，而对照组的中和抗体在攻毒后才开始升高；而S蛋白免疫组SARS-CoV病毒载量高于对照组（P＜0.05），肺部出现更多促炎的巨噬细胞浸润和抗炎的巨噬细胞减少，且出现更严重的病理性损伤。AGRAWAL等[19]用MERSr-CoV的灭活疫苗免疫小鼠，MERSr-CoV攻击后，小鼠肺内单核细胞浸润增加，白细胞介素5、白细胞介素13水平升高，肺部病理性损伤加重。

对SARS-CoV-2感染导致的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的流行病学调查发现，大多数COVID-19患者症状较轻，重症患者多患有基础疾病，且一部分患者表现为病情进展迅速，出现细胞免疫缺陷、凝血系统活化、心肌损伤、肝脏损伤、肾脏损伤及继发性细菌感染等。在大多数重症和死亡的COVID-19患者中，都观察到淋巴细胞减少和持续的炎症。而这些症状与严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）患者相似[20]。AGRAWAL等[19]认为可能是这些患者曾感染冠状病毒产生抗体，再次感染SARS-CoV-2后产生ADE，导致病情恶化。CHAN等[21]的研究结果显示，SARSr-CoV恢复期患者血清可与人冠状病毒EMC（human coronavirus EMC，hCoVEMC）发生交叉反应，因此他们认为使用SARS患者恢复期血浆治疗hCoV-EMC感染时，应考虑低水平中和抗体导致ADE的可能性。

2 冠状病毒ADE的作用机制

传统意义的ADE是指当病毒初次感染刺激机体产生针对此类血清型特定的中和抗体，若二次感染不同亚型或变异的病毒，现存的抗体不能中和该类病毒，形成病毒-抗体免疫复合物，与免疫细胞上的IgG Fc受体（Fc receptor，FcR）或补体受体结合进入细胞，从而发生ADE。

LIU等[18]的研究结果显示，不管是在猕猴还是人类体内，靶向SARSr-CoV S蛋白的IgG抗体均加重了SARSr-CoV攻毒后的机体肺部促炎性巨噬细胞浸润和病理性损伤，而未免疫S蛋白IgG抗体的机体抗炎性巨噬细胞浸润增加。这一现象均由FcR介导发生[18]。JAUME等[22]通过监测不同FcR表达模式的免疫细胞系的易感性，证实人FcRⅡ比FcRⅠ和FcRⅢ更易介导SARSr-CoV的ADE。这与黄病毒的ADE类似[23]。用单抗封闭细胞的FcRⅠ或FcRⅢ对Raji B细胞和Daudi细胞的ADE无影响，但封闭FcRⅡ完全消除了这些细胞的ADE[22]。与ACE2受体介导的感染不同的是，FcRⅡ介导的ADE不经过pH值依赖的包涵体或溶酶体途径，且受半胱氨酸蛋白酶活性的影响较小，即SARSr-CoV可通过抗体介导机制进入常规病毒受体表达阴性，而FcR阳性的靶细胞[22]。

WAN等[24]提出人冠状病毒ADE的机制是针对S蛋白的抗体通过FcRⅡ介导人冠状病毒进入细胞，与登革病毒促使免疫细胞发生ADE的机制类似，在敲除或表达MERSr-CoV高亲和力受体——二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）的情况下，其单抗Mersmab1与MERSr-CoV结合，触发S蛋白构象改变，激活蛋白酶水解，诱导病毒包膜与细胞膜融合。同时Mersmab1结合免疫细胞表面IgG FcR，通过典型的病毒受体依赖途径感染细胞[24]。

CARDOSA等[25]的研究结果显示，补体受体（complement recptor，CR）3能增强黄病毒感染巨噬细胞的能力。随后有学者在对HIV-1的研究中发现，在亚中和水平HIV-1特异性抗体存在的情况下，CR3、C1q受体、CR2介导HIV-1抗原抗体复合物进入T淋巴细胞系[26-27]。而CR是否参与冠状病毒的ADE，还有待于进一步研究加以验证。

3 冠状病毒ADE的影响因素

人冠状病毒ADE受多种因素影响，包括病毒感染量、抗体水平、抗体与受体亲和力、病毒受体和FcR的组织特异性表达等，探讨核心因素并进行改造和消除，是当前ADE研究的重点。

3.1 包膜蛋白

人冠状病毒包膜S蛋白在病毒吸附、融合、进入细胞及宿主免疫中起重要作用[28]。中和SARSr-CoV主要是通过阻断S蛋白和ACE2之间的相互作用[29]。

S蛋白包含S1、S2亚基。S1亚基主要分为N端域（N terminal domain，NTD）和受体结合区（receptor binding domain，RBD），负责识别与结合细胞的受体。RBD主要由受体结合基（receptor binding motif，RBM）和核心区组成。不同冠状病毒S蛋白的核心区高度保守，而在受体识别中发挥关键作用的RBM空间构象各有不同，这决定了冠状病毒识别细胞受体的特异性[15]。针对冠状病毒RBD的特异性抗体能与S蛋白RBD结合，产生中和作用。生物信息学分析结果显示，不同的人冠状病毒之间S蛋白有重叠区域，如hCoV-EMC和SARSr-CoV的S1亚基RBD氨基酸序列之间仅有16.6%的差异[21]。S2亚基含有膜融合过程所需的基本元件[15]。在感染过程中，人冠状病毒首先通过S1亚基RBD与宿主细胞膜受体相互作用、结合，触发S2亚基的构象变化，导致膜融合并进入靶细胞。

YUAN等[30]证实靶向人冠状病毒RBD的特异性中和抗体能介导ADE。人冠状病毒有2种状态的RBD，分别是横卧和直立状态；而SARSr-CoV、MERSr-CoV的RBD均为直立状态，这有利于与受体结合[30]。SARSr-CoV特异性抗体与ACE2对应的SARSr-CoV RBD结合，可稳定RBD的直立状态并触发S蛋白的构象变化[31]，并介导SARSr-CoVpp感染细胞导致ADE[24]。与SARSr-CoV相似，单克隆抗体需与MERSr-CoV S蛋白RBD结合并保持RBD的直立状态，才能触发MERSr-CoV S蛋白的构象变化，并将S2位点暴露给蛋白酶[15]，从而融合细胞膜，感染细胞。MERSr-CoV RBD中和抗体与病毒受体一样，能与S蛋白RBD结合，并触发RBD的构象变化，阻断RBD与表达DPP4的细胞结合和病毒感染，而后通过FcR途径感染人类细胞[24]，即RBD单克隆抗体通过功能性模仿病毒受体DPP4来介导冠状病毒发生ADE。

WALLS等[16]的研究证实SARS-CoV-2 S蛋白可诱导机体产生中和抗体，是SARS-CoV-2诊断、治疗和疫苗研发的重要靶标。既往研究结果表明，基于重组全长S蛋白的候选疫苗增强了SARSr-CoV感染THP-1、Raji B细胞、Daudi细胞和HL-CZ细胞的能力。来源于SARSr-CoV感染患者的高浓度抗体促进了SARSr-CoV感染人HL-CZ细胞及细胞凋亡，这种ADE现象与SARSr-CoV S蛋白有关，与N蛋白无关[32]。

3.2 与受体的亲和力

不同的冠状病毒株与ACE2的亲和力不同，因此病毒的感染力、传播力及造成的人体病理性改变也不同。有些病毒株可感染人类，但并不在人类之间传播，而有些病毒株对人类细胞具有高感染力，可形成跨物种传播。

YANG等[33]的研究结果显示，SARSr-CoV特异性抗体是中和病毒，还是产生ADE，与病毒-受体亲和力有关，即使用同源S蛋白免疫动物的抗血清，对人ACE2亲和力较低的病毒更难以中和，更易出现ADE现象。而与人ACE2有高亲和力的人源病毒株还未进化到可以逃避这种免疫选择[33]。虽然人冠状病毒NL63（human coronavirus NL63，hCoV-NL63）与SARSr-CoV属于不同冠状病毒属，但二者均可通过与ACE2受体发生作用进入细胞。与SARSr-CoV相比，hCoV-NL63与ACE2的亲和力较弱，仅导致轻微的呼吸道感染症状[34]。

WRAPP等[35]通过冷冻电镜技术解析了SARS-CoV-2 S蛋白的三聚体结构，发现其更容易与细胞表面的ACE2结合，SARS-CoV-2与ACE2的亲和力是SARSr-CoV S蛋白与ACE2亲和力的10～20倍。YAN等[36]发现ACE2以二聚体的形式存在，同时具有开放和关闭2种构象，且2种构象都有冠状病毒结合域，1个ACE2二聚体能结合2个SARSr-CoV的S蛋白。与ACE2的高亲和力对SARS-CoV-2 ADE发生机制的影响仍需进一步证明。

3.3 抗体

有学者[5]发现，SARS-CoV-2患者在发病后第9天IgM抗体达到峰值，并在第2周转换为IgG抗体。LIU等[37]发现SARSr-CoV感染机体后最早在发病第4天发生抗体转换，大多数患者是在14 d后发生抗体转换。特异性IgG抗体和中和抗体的存在时间可长达2年，以保护机体[37]。MERSr-CoV感染后在发病的第2周或第3周出现抗体转换，且SARSr-CoV、MERSr-CoV引起的抗体反应时间和强弱均与疾病预后相关[38]。

WAN等[24]分析了不同剂量的MERSr-CoV高亲和力单抗Mersmab1对MERSr-CoV ADE的影响，证实了复杂的抗体剂量依赖模式，细胞同时表达DPP4和FcR，可通过改变抗体剂量来确定DPP4依赖或抗体依赖的ADE途径之间的平衡。他们认为MERSr-CoV ADE一般在中等抗体剂量下发生[24]，这与登革病毒的ADE仅在存在一定浓度的抗体时发生[39]相似。

在动物实验中，基于SARSr-CoV全长S蛋白开发的候选疫苗被证明可诱导非中和抗体，这些抗体不但不能预防SARSr-CoV感染，不能保护免疫动物不受病毒感染，反而导致了疾病进展，如肝炎加重、发病率升高和更强的炎症反应[40-41]。由于SARSr-CoV和MERSr-CoV在分类学和结构上的相似性，这2种病毒的新疫苗研发过程在很大程度上是相似的。许多针对MERSr-CoV的潜在疫苗也主要集中在相同的全长S蛋白上，这引起了学者们对这些疫苗实际应用安全性的关注[42]。

4 SARS-CoV-2 ADE相关研究展望

4.1 疫苗的研发

SARS-CoV-2作为新发现的人冠状病毒，针对其免疫机制，尤其是ADE方面的研究甚少。总结、概括与SARS-CoV-2同源的人冠状病毒的ADE研究进展，能为SARS-CoV-2抗体相关药物开发、免疫治疗及疫苗研发等提供一定的参考，甚至为今后可能再次发生的冠状病毒跨种属传播提供一些背景信息。

自COVID-19疫情暴发以来，国内外很多生物制药公司或学术机构都积极进行多种类型预防性疫苗的研发，包括mRNA、DNA、腺病毒载体和重组蛋白等[43]。而针对SARSr-CoV的多种疫苗，如灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒和细菌载体疫苗、重组蛋白和DNA疫苗等已进入临床试验阶段[44]。ADE是疫苗设计及研制的主要障碍，此过程中接种疫苗的个体的疾病进展比未接种疫苗的个体更为严重。免疫力低下、患有基础疾病者更应重视及预防ADE的发生。针对S蛋白开发的候选疫苗存在ADE的风险，而同样基于S蛋白的病毒载体疫苗诱导的中和性应答同样存在引起ADE的可能[29]。

目前，有2种方法可以减轻ADE的不良影响：第1种方法是通过糖基化来屏蔽S蛋白的非中和表位；第2种方法是引导适应性免疫反应，只针对关键的中和表位，诱发更强的保护性免疫[45-46]。对第2种方法的支持证据是基于较短S1区的MERSr-CoV候选疫苗比基于全长S蛋白的疫苗有更强的中和活性[46]。此外，基于更短RBD的候选疫苗可诱导较高的中和免疫反应[46]。体外研究结果显示，人冠状病毒S蛋白RBD的单克隆抗体可通过模仿病毒受体的功能来介导ADE[24]。如果靶向中和性抗体中其他不触发其构象变化的亚基，则可能不会引起ADE。基于相同的原理，可以选择靶向S蛋白其他部位的中和性单克隆抗体来治疗病毒感染。

4.2 动物模型的筛选

SARS-CoV-2 感染性动物模型的建立是进行疫苗研制及药物筛选的关键环节。多种动物模型已被用于人冠状病毒研究。表达人ACE2的转基因小鼠AC70和AC63被开发为SARSr-CoV感染的动物模型。SARS-CoV-2同样通过人ACE2受体进入细胞，这为SARS-CoV-2动物模型的开发提供了参考[47]。多种非人灵长类动物，如恒河猴、非洲绿猴、狨猴等都可感染SARSr-CoV，可用于SARSr-CoV感染模型的研究。SARSr-CoV感染不同种类的动物后，出现的症状不同[41-43]。恒河猴可自然感染MERSr-CoV，出现一系列轻度感染症状，不会出现致死性感染[44-46]。用同样方式接种MERSr-CoV后，狨猴中部分感染动物可表现为致死性感染[47]。研究人员尝试用捕获的果子狸作为SARSr-CoV感染的动物模型，但果子狸感染SARSr-CoV后不出现重症感染症状，不会导致死亡[48-49]。现有的研究结果显示，仅在上述一小部分SARSr-CoV动物实验中观察到了ADE，如用表达SARSr-CoV S蛋白的安卡拉痘病毒载体免疫雪貂后，增加了动物体内的病毒载量，加重了肝脏病变，但在其他疫苗接种组中未观察到ADE。不同动物模型和不同疫苗亚型、剂量、免疫方式等都影响着ADE的发生。目前尚未在体内实验中观察到MERSr-CoV的ADE现象[44]。如何有效地建立感染性动物模型并鉴定、评价疫苗是否有效是当前SARS-CoV-2疫苗研发面临的重要问题。

目前，科学家正在对SARS-CoV-2进行层层剖析，包括病毒结构、与人ACE2受体的相互作用、病毒传染性及流行病学等诸多方面。病毒的遗传差异性高，其ADE的差别甚大，这种差异关系到疫苗的研发，因此有必要深入探讨ADE在病毒致病机制中的地位和作用，从而对候选疫苗进行修饰处理或淘汰，以尽早研制出安全、有效的疫苗。