miR-34a及其下游因子Bcl-2、TGF-β1在胆管癌发展中的作用

徐志诚 陈晓宁 李春海 王晓东

6月-2018年6月86例本院收治的胆管癌患者（试验组）及86例健康人（对照组）的资料，并取其血清利用实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）测试miR-34a表达水平，同时检测调控因子Bcl-2、TGF-β1的表达量。结果：试验组miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表达量均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.001）;不同miR-34a表达程度胆管癌患者性别、年龄、分化程度比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;miR-34a高表达患者TNM分期、Bcl-2、TGF-β1与miR-34a低表达患者比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。试验组化疗后miR-34a、TGF-β1及Bcl-2表达量均明显低于化疗前，差异均有统计学意义（P<0.001），胆管癌患者血清miR-34a与Bcl-2、TGF-β1均呈正相关（r=0.872、0.876，P=0.041、0.003）。结论：胆管癌患者miR-34a表达量明显高于健康人，可能与调控下游Bcl-2、TGF-β1的表达量有关，此外miR-34a、Bcl-2及TGF-β1随患者的治疗活动变化产生相应改变，可见三者可作为胆管癌诊疗的潜在位点。

【关键词】 胆管癌 调控网络 化疗治疗 相关性分析

[Key words] Cholangiocarcinoma Regulatory network Chemotherapy Correlation analysis

First-author’s address： Jiamusi Central Hospital， Jiamusi 154002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.18.035

胆管癌是一种源于肝外胆管的恶性肿瘤，且近年来发病率逐渐上升[1-2]。目前临床上外科手术是治疗该病的主要方法，但是到了癌症晚期，肿瘤分化程度高，手术治疗效果往往较差，而化疗成为治疗该病晚期主要的治疗方法[3]。然而，大量研究报道，胆管癌患者对化疗不敏感，且治疗效果较差，可能与miR-34a及其下游调控的Bcl-2、TGF-β1因子存在密切相关性[4-5]。故研究miR-34a在胆管癌患者的表达及其化疗前后变化，在一定程度上可提高患者的临床治疗效果并对患者的远期预后具有重大的意义。鉴于此，本中心分析miR-34a及其的下游Bcl-2、TGF-β1因子的表达及其化疗前后变化，为临床进一步提高胆管癌的治疗提供新的理论依据和研究方向。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年6月-2018年6月本院收治的86例胆管癌患者（试验组）及同期于本院体检的86例健康人（对照组）的资料。纳入标准：经病理证实为胆管癌;年龄25～75周岁;无其他远处转移。排除标准：合并其他重大器官功能不全;免疫功能缺陷;存在恶病质。入选人员收集资料均完整，且知情并同意本次研究，并通过本院伦理委员会的认证。

1.2 实验试剂与仪器 试剂：miR-34a（上海吉玛科技有限公司），细胞裂解液（美国Initrogen公司），miR-34a提取分离试剂盒（北京天根生化科技有限公司），miR-34a逆转录引物及逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），Bcl-2、TGF-β1试剂盒（Santa公司，美国）。仪器：实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）仪（美国ABI公司），低温高速离心机（美国Eppendorf公司），酶联免疫吸附法试剂盒（Infinite F 50，帝肯公司，瑞士）

1.3 方法 （1）miR-34a的提取：取两组清晨空腹静脉血各5 mL，离心分离后取血清，加入等体积的细胞裂解液。再12 000 r/min离心10 min加入氯仿。然后进行震荡，12 000 r/min离心30 s，取水相层，并加入其1/3的无水乙醇，倒入吸附柱，再进行12 000 r/min离心30 s。重复过柱遴选后，加入500 μL去蛋白液，再进行12 000 r/min离心30 s。而后加入漂洗液，进行12 000 r/min离心120 s，向吸附柱中加入30 μL去离子水，在室温下放置12 s后，再进行12 000 r/min离心120 s得到miR-34a。（2）qRT-PCR：反应条件为95 ℃，10 s、20 s;62 ℃，40 s，共40个循环，采用相对定量法测试miR-34a的表达量。获取两组研究对象的外周静脉血5～7 mL，加入抗凝管，然后放入离心机，3 000 r/min的速度离心，分离上清液，放入-80 ℃保存备用。具体操作方法按照试剂盒的方法操作进行Bcl-2、TGF-β1的检测。（3）化疗药物：吉西他滨（生产企业：ELI LILLY AND COMPANY，批准文号：注册证号H20110535，规格：200 mg）进行化疗。（4）测定miR-34a的表达量高于中位数的定义为高表达，低于中位数的定义为低表达。

1.4 观察指标 比较两组miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表达量，比较不同miR-34a表达情况胆管癌患者临床资料，比较试验组化疗前后miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表達量，分析miR-34a与其下游因子的相关性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;采取Pearson相关分析评价miR-34a与其下游因子的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 试验组，男49例，女37例;年龄37～59岁，平均（48.24±7.23）岁。对照组，男48例，女38例;年龄37～60岁，平均（48.31±7.35）岁。两组性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表达量比较 试验组miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表达量均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.001），见表1。

2.4 试验组化疗前后miR-34a、Bcl-2及TGF-β1表达量比较 试验组化疗后miR-34a、TGF-β1及Bcl-2表达量均明显低于化疗前，差异均有统计学意义（P<0.001），见表3。

3 讨论

胆管癌是常见的恶心肿瘤之一，其主要的临床表现为黄疸、胆囊肿大、肝脏损害、胆道感染和出血等，严重危及患者的生命安全[6]。有研究报道，该病病因可能与胆管结石、原发性硬化性胆管炎等疾病有关，目前临床上治疗该病的方法有手术治疗、放射治疗、化学治疗等方法，其中手术治疗是针对早期病例的有效治疗方法，而放射治疗、化学治疗是针对胆管癌晚期患者的治疗方法[7-8]。但文献[9-10]报道，胆管癌晚期患者进行化疗时，往往效果较差，患者的耐药性较差，严重影响治疗效果，因此探究胆管癌患者弱化疗性的原因对胆管癌患者具有重大的临床意义。

目前miR-34a为多种肿瘤的有效诊断指标之一。此外同时有研究报道，胆管癌的发生发展及转移性与miR-34a关系密切[11-12]。而最新的研究也证实了miR-34a同样参与了胆管癌患者对化疗药物的耐药性[13]。

上皮间质转化（EMT）已经被证实参与多种癌症的发生，如乳腺癌、子宫颈癌、肝细胞癌等，而上皮间质转化同样参与了胆管癌的发生。而miR-34a通过调节其下游的TGF-β1的过表达，诱导了肿瘤的发生并促进了EMT的发生从而参与了胆管癌的发生发展及转移。而本研究结果也证实了胆管癌患者血清miR-34a和TGF-β1的表达量均高于健康人群，此外，miR-34a表达与TNM分期有密切的关系，且随着胆管癌患者临床分期的进展，miR-34a表达逐渐升高。证实了miR-34a和TGF-β1参与了胆管癌的病理过程，佐证了既往的研究[14]。

而Bcl-2作为调控抗凋亡蛋白家族成员，其量的过度表达同样参与了胆管癌的转移。而本研究结果也提示胆管癌患者的血清Bcl-2高于健康对照组，同时了证明了之前研究关于Bcl-2参与了胆管癌发展的结论[15]。

同样有研究证实了miR-34a参与了胆管癌抗化疗性，其同样TGF-β1和Bcl-2来实现的，前者是通过EMT获得了间叶细胞的侵袭能力来降低化疗药物的敏感性，而Bcl-2则通过抗凋亡作用来降低胆管癌细胞对化疗药物的耐药性[16]。而本研究结果显示化疗前后上述三项指标均较治疗前降低，与既往的研究结果相似[17]。

最后，本研究结果显示miR-34a与Bcl-2、TGF-β1均呈正相关（P<0.05），足见miR-34a通过一系列机体内的生物信号传导途径，达到了调控Bcl-2、TGF-β1量的目的，最终实现了调控胆管癌发生发展以及对抗化疗药物的生物效应，既往的研究也得出类似的研究结论[18]。

综上所述，miR-34a通过调控机体Bcl-2及TGF-β1的过表达参与了胆管癌的发生及预后，其可作为临床评估胆管癌诊疗的重要指标，有成为胆管癌治疗靶点的潜在可能。但本研究为单中心研究且研究个体量偏少，需要多中心联合大样本量来进一步证实miR-34a在胆管癌的角色定位。另外，microRNA的进一步分类研究也是下一步的研究重点。

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（收稿日期：2020-08-17） （本文编辑：程旭然）