LAMP法、ADA法在结核性胸膜炎诊断中的应用比较

陈沃庆

【关键词】 LAMP法 ADA法 结核性胸膜炎

[Abstract] Objective： In order to better understand the situation of tuberculous pleurisy in patients， LAMP and ADA were used to diagnose patients in this study and their diagnostic value was discussed. Method： A total of 80 patients with suspected tuberculous pleurisy in our hospital from May 2019 to April 2020 were selected. All patients were tested by LAMP and ADA. The clinical diagnostic criteria were taken as the gold standard， ADA and LAMP in the diagnosis of tuberculous pleurisy were analyzed， and the diagnostic efficacy of ADA and LAMP in the diagnosis of tuberculous pleurisy was compared. Result： The accuracy of ADA and LAMP in the diagnosis of tuberculous pleurisy were 81.25% and 51.25% respectively. The sensitivity of ADA in the diagnosis of tuberculous pleurisy was 91.2%， which was higher than 44.1% of LAMP （P<0.05）. The specificity of ADA in diagnosis of tuberculous pleurisy was 25.0%， which was lower than 91.7% of LAMP （P<0.05）. Conclusion： In the diagnosis of tuberculous pleurisy， there are some differences between the sensitivity and specificity of LAMP and ADA. LAMP can effectively improve the specificity. Therefore， this diagnostic method can effectively help doctors improve the judgment ability of patients’ disease， formulate accurate and effective treatment methods， and improve the current state of patients， clinical application should be further promoted.

[Key words] LAMP ADA Tuberculous pleurisy

First-author’s address： Jiangmen Central Hospital of Guangdong Province， Jiangmen 529000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.18.036

結核性胸膜炎是结核分枝杆菌和代谢的产物感染胸膜腔之后发生的炎症性病变。临床中这种疾病一般会伴有胸腔积液，并且发展较为迅速，临床中的诊断主要有免疫学检查、影像学检查、胸水检查等[1]。细菌学和组织病理学虽然也有检测的效果，但组织病理学检查会对患者产生一定的创伤，且操作过程比较复杂，所以一般不实施[2]。细菌培养阳性概率较低，因此寻找患者容易接受并且操作简单，同时伴有特异性、敏感性较高的诊断方式在临床中有一定的意义[3]。随着免疫学、生物学的发展，免疫检测和各种分子技术是诊断结核性胸膜炎的新方式[4]。腺苷脱氨酶（adenosine deaminase， ADA）是较多学者公认的诊断指标。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）属于新型的核酸检验技术，和传统的技术进行对比，其只需恒定温度就能进行扩增反应[5]。以上几种方式检测对患者的价值暂不清楚，所以本次研究的目的是为了探讨其价值，提供临床依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年5月-2020年4月本院疑似结核性胸膜炎的患者80例，男55例，女25例;年龄35～78岁，平均（55.3±2.7）岁。（1）纳入标准：①患者病理学、影像学、细菌学诊断确诊为结核性胸膜炎;②参与研究前没有接受过化疗、放疗、手术治疗。（2）排除标准：①患者的依从性较差;②对于每项检测均有排斥感;③肾、肝、心功能异常。患者均知晓本次研究，并签署同意书表示自愿参与，同时经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 ADA法 使用的是Olympus AU5431型全自动生化分析仪，由日本Olympus公司所提供，试剂使用的是原装配套，具体操作严格按照说明书进行。将5 mL的胸腔积液放置到黄色的生化管中，离心10 min，3 000 r/min分离血清，选取上清液进行测定。

1.2.2 LAMP法 使用的广州迪澳生物科技有限公司生产的恒温扩增仪，以及原装的试剂盒。将等待检验的痰样本放置到4%氢氧化钠中，涡旋振荡15 s，室温放置15 min，吸取1 mL加入带旋盖离心管中，时间为5 min，转速设定为12 000 r/min，将上清液丢弃，加入DNA提取液100 μL，涡旋混匀15 s，恒温100 ℃加热10 min，温度保持在100 ℃，离心2 min（12 000 r/min），选取上清液进行备用。核酸扩增反应体系：将上清液2 μL放置到反应管中，每支反应管中都包含密封液20 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、反应液22 μL，离心5 s，转速为10 000 r/min，扩增仪温度保持在63 ℃，时间为45 min。

1.3 观察指标及判定标准 （1）ADA法对结核性胸膜炎诊断情况。（2）LAMP法对结核性胸膜炎诊断情况。（3）比较ADA法和LAMP法对结核性胸膜炎的诊断效能。金标准的诊断标准为以《肺结核诊断》（WS 288-2017）为主的影像学提示胸腔积液（干性胸膜炎可无异常），同时满足以下任何一条，即可确诊：胸膜病理检查支持结核;胸水抗酸杆菌阳性2次;胸水抗酸杆菌阳性1次，结核分枝杆菌培养阳性1次。ADA法结核阳性的判定标准为：ADA 45 U/L。LAMP法结核判定标准为结果显示为S型扩增曲线，可以定为阳性，说明包含结核分枝杆菌，相反就是阴性，并不包含。诊断准确率=（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100%;灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%;特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADA法对结核性胸膜炎诊断情况 ADA法诊断结核性胸膜炎的准确率为81.25%，见表1。

2.3 ADA法和LAMP法对结核性胸膜炎诊断效能比较 ADA法诊断结核性胸膜炎的灵敏度为91.2%、特异度为25.0%;LAMP法诊断结核性胸膜炎的灵敏度为44.1%、特异度为91.7%。ADA法的灵敏度高于LAMP法（P<0.05），LAMP法特异度高于ADA法（P<0.05），见表3。

结核病属于慢性传染性疾病的一种，是由结核分枝杆菌引起的，属于三大传染病中的一种[6]。从1940年开始，抗结核药物不断的制作出来，全球结核病情被控制，病死率、患病率、感染率有所下降[7]。但近几年，结核病再次席卷而来，病情更加严重[8]。2016年的报告显示，2015年全球大约有1 050万结核病新发患者，其中大约有145万人因为结核病死亡[9]。我国患病人数在世界中排名第二，仅低于印度，其发病率为68/100 000，病死率为39/100 000;2016年我国新发生结核病的人员有90.1万人，报告的案例有80.4万例，人民群众的生命和健康受到威胁，所以结核防治工作在临床中有一定的意义[10]。

結核疾病中，结核感染的主要表现是结核性胸膜炎，是继淋巴结核之后第二位肺外结核病[11]。结核性胸膜炎主要的表现是胸腔积液，胸膜活检病理、胸水培养、胸水查抗酸杆菌等作为其确诊依据，胸膜病理和胸水查抗酸杆菌最终的结果阳性率并不高，结核杆菌培养的时间比较长，误诊、漏诊、延误诊断的事件易发生。漏诊、延误治疗都会导致患者的病情加重，病死概率也会有所增加[12]。使用抗结核治疗会出现较为严重的不良反应。所以为了更好地增加诊断结核性胸膜炎的概率，需要一种特异度、灵敏度均较高、快速、简单的检查方式，以早期诊断和治疗[13]。通过不断的研究，使用LAMP技术对痰涂阴肺结核以及肺结核进行诊断，其概率较高，但是对于结核性胸膜炎的相关报道较少，故本次研究的目的为探讨其对结核性胸膜炎的诊断价值[14]。

LAMP技术在2000年被日本学者发明，属于较为新型的一种恒温体外核酸扩增技术，环介导等温扩增技术，主要依赖的是两种特异的内部引物识别靶基因和两条特异的外部引物的6个区域，使用具有链置换特性的DNA聚合酶，在温度为61～65 ℃的环境中恒温快速扩增DNA分子[15-16]。属于新型的检测核酸的方式，这种操作方法不仅具有特异性高、扩增产物容易检验、产物大、扩增反应快、操作简单等优势，还可以为快速病原学检验提供一定的帮助。这项技术在近几年的结核诊断中具有良好价值[17]。

关于结核性胸膜炎使用LAMP诊断的价值目前临床中并没有详细的描述，样本量较少，在研究过程中使用的引物是自行设计的，同时实施H37Rv菌株阳性对照检测，检测的方法不仅操作繁琐且标准化不统一，难以全面开展，所以如果可以研究出简易方便、标准化的方法，鉴定结核性胸膜炎中所包含的胸腔积液结核杆菌，在临床中具有重要的意义[18]。在本次研究过程中，通过使用LAMP法对结核性胸膜炎患者实施胸腔积液结核杆菌的检验，和胸膜病理活检、胸水ADA[19-20]。

通过使用ADA可以有效增快底物腺苷的分解速度、氨或者次黄苷等生成量，还可以帮助终产物尿酸生成量改变，实施淋巴细胞、红细胞、体液、血清的ADA活性测定。在1978年的学者首先对胸腔积液ADA活性可以作为鉴别和诊断胸腔积液以及诊断胸膜炎的一种依据。发生结核性胸膜炎过程中，宿主可以根据细胞免疫有效的抵抗结核病，ADA在单核细胞成熟成为巨噬细胞以及淋巴细胞的分化中，均会起到作用，因为受到细胞免疫的刺激，所以淋巴细胞会不断增加，所以ADA在胸腔积液中的含量会不断增加，癌性胸腔积液过程中，ADA的活性会降低，抑制T淋巴细胞增殖。所以在研究过程中，结核性胸腔积液中主要包含的是ADA2、ADA1，但是这种酶细胞来源并不确定，胸腔中的问皮细胞和单核巨噬细胞可能性较大。ADA的活动虽然可以作为鉴别胸腔积液的主要标志物，但是效果远没有LAMP法好，本研究结果显示，ADA法诊断结核性胸膜炎的灵敏度为91.2%、特异度为25.0%;LAMP法诊断结核性胸膜炎的灵敏度为44.1%、特异度为91.7%。ADA法的灵敏度高于LAMP法（P<0.05），LAMP法的特异度高于ADA法（P<0.05），因为ADA在检测中具有一定的活性所以敏感度会高于LAMP法，但是LAMP法操作过程比较简单，对于仪器设备要求比较低，检测出的最终结果比较清晰，所以特异度高于ADA法，LAMP法作为临床诊断结合新胸膜炎有一定的价值性。

综上所述，在结核性胸膜炎诊断中，LAMP法可以有效提高特异度，帮助患者得到更加准确的治疗，临床上应当进一步推广应用。

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（收稿日期：2020-08-26） （本文编辑：姬思雨）