不同结构改性与美拉德反应前后鲜味二肽（Asn-Pro和Ala-His）呈味特性的对比分析

赵炫，苏国万，赵亚琦，华彦涛，李宝玉，尹凯丹

（1.广东农工商职业技术学院热带农林学院，广东广州 510507）

（2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

鲜味肽是一类能够弥补或强化食品原有风味的肽，它可以改善食品品质、提高味觉感知以及增进消费者食欲，可通过动植物蛋白酶解或发酵获得[1]。最早Yamasaki 等[2]从木瓜蛋白酶水解牛肉产物中分离得到一种风味美味的组分（Lys-Gly-Asp-Glu-Ser-Leu-Leu-Ala），并将其命名为美味肽（BMP）。随后，鲜味肽引起了研究者们的广泛关注和研究，如Rhyu等[3]研究发现韩国豆酱水提物中相对分子量在500～1000 u 的小分子肽组分具有较强的鲜味；Su 等[4]从花生粕酶解产物中分离纯化鉴定出2条具有鲜味和增鲜作用的肽；Zhang 等[5]在花生分离蛋白酶解液中分离纯化得到6 条鲜味肽等。但是这些研究主要集中在酶解液中鲜味肽的分离纯化和鉴定方面，对于鲜味肽的构效关系的研究尚且不明晰。而呈味肽的结构对其呈味特性具有至关重要的影响，呈味肽的呈味特性与氨基酸性质、氨基酸组成、氨基酸序列以及肽的空间结构等密切相关[6]，因此，研究鲜味肽的结构与呈味特性的关系对于丰富呈鲜机理具有及其重要的意义。

美拉德反应是羰基化合物（还原糖类、醛类、酮类）与氨基化合物（蛋白质、肽、游离氨基酸、胺等）之间发生一系列复杂化学反应最终生成类黑精物质的一种反应[7]。有研究表明，肽和还原糖发生美拉德反应后可提升其鲜味特性，如康乐[8]通过对牛肉中具有美拉德反应风味活性的肽进行分离鉴定，发现Glu-Cys-Gly、Leu-Cys、Val-Met 和Cys-Gly-Val 美拉德反应产物具有肉香、鲜味、醇厚感，同时对鸡汤溶液的鲜味和醇厚感提升效果十分明显；张佳男[9]研究发现花生鲜味肽与木糖进行美拉德反应可进一步提升其鲜味强度；刘平[10]研究发现大豆肽的美拉德反应产物可使鸡汤呈现更好的鲜味、醇厚味和持续感，且减弱其焦甜味、酸味和苦味，并且使得鸡汤整体风味更协调。

电子舌是一种模拟人的舌头对液体样品进行分析、识别和判断的一种味觉智能识别检测仪器，与传统的感官评价结果相比，电子舌检测结果具有更加快速、稳定和标准等优点[11]。近些年来，电子舌已广泛应用于呈味肽的研究，如苗晓丹等[12]在利用酶水解养殖暗纹东方鲀肌肉制备呈味肽的研究中，发现电子舌能够明确区分出不同蛋白酶酶解液；惠延波等[13]利用电子舌对大豆肽溶液进行定性分析，发现判别因子分析法（DFA）对不同大豆肽样品的区分效果好，区分指数DI=100，并能准确对未知样品进行呈味预测，识别率为100%；刁静雯等[14]通过电子舌检测与人工感官评价对甲鱼肉酶解液滋味分析，发现两者间具有较为一致的评定效果，而电子舌在对每种滋味强弱的评价上更为灵敏。

鲜味肽Asn-Pro 和Ala-His 是两条从酱油中分离鉴定得到的具有明显鲜味和鲜味增强作用的肽[15]，为了进一步研究结构改性（氨基酸顺序改变、增加鲜味氨基酸、串联肽）以及美拉德反应对其呈味特性的影响，在前期研究的基础上，定向合成Asn-Pro、Ala-His、Pro-Asn、His-Ala、Glu-Asn-Pro、Asn-Pro-Glu、Asp-Asn-Pro 、 Asn-Pro-Asp 、 Asn-Pro-Asn-Pro 、Ala-His-Ala-His、Asn-Pro-Ala-His 和Ala-His-Asn-Pro，并利用电子舌分析其呈味特性的差异。

1 材料与方法

1.1 原料

酱油由海天调味食品股份有限公司提供；柠檬酸、蔗糖、咖啡因、食盐、味精、葡萄糖均为食品级，由广东天企生物科技有限公司提供；合成肽Asn-Pro、Ala-His、Pro-Asn、His-Ala、Glu-Asn-Pro、Asn-Pro-Glu、Asp-Asn-Pro 、 Asn-Pro-Asp 、 Asn-Pro-Asn-Pro 、Ala-His-Ala-His、Asn-Pro-Ala-His 和Ala-His-Asn-Pro购买于上海吉尔生化有限公司；氯化钾、酒石酸、无水乙醇、氢氧化钾、盐酸、氯化银、三氟乙酸（TFA）均为分析纯；乙腈和甲醇为色谱级。

1.2 主要仪器设备

AL204 电子天平，瑞士梅特勒-托利多集团；TS-5000Z 电子舌，日本Insent 公司；Waters600 高效液相色谱仪，美国Waters 公司；DF-101S 磁力加热搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；Milli-Q 超纯水仪，美国MilliPore 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 合成肽的纯度检测

采用高效液相色谱（HPLC）对合成肽进行纯度检测，将合成肽配置成5 mg/mL 的溶液，色谱柱为Welch CX-C18（4.6×250 mm，5 µm），流动相为A：0.1% TFA 乙腈溶液；B：0.1% TFA 水溶液。采用梯度洗脱：0～0.1 min，0～3% A，100%～97% B；0.1～25 min，3%～28% A，97%～72% B；25～25.1 min，28%～100% A，72%～0% B；25.1～30 min，100% A。进样体积为10 μL，流速为1 mL/min，检测波长为220 nm。

1.3.2 味觉传感器和参比电极的活化

用超纯水配制味觉传感器基准液（30 mM KCl+0.3 mM 酒石酸）和内部液（3.3 M KCl+饱和氯化银），在味觉传感器探头内加入200 μL 内部液，并将味觉传感器置于装有基准液的烧杯内，用保鲜膜密封烧杯口，25 ℃活化24 h 待用；用超纯水配制参比电极内部液（3.3 M KCl+饱和氯化银）和3.3 M KCl溶液，在参比电极探头内加入200 μL 内部液，直至液面距离玻璃管顶部约5 mm 的位置，并将参比电极置于装有3.3 M KCl 溶液的烧杯内，液面距离电极头约15 mm，用保鲜膜密封烧杯口，25 ℃活化24 h 待使用。

1.3.3 电子舌的数据采集

电子舌能感知液体环境中的不同味感（酸、甜、苦、咸、鲜味），将待测样品的化学信号转化为电信号，电信号通过信号采集单元和模式识别系统转化成电势差，其输出值即为电子舌评分。根据待测样品的化学成分不同，电子舌评分存在差异，可以用来判断其呈味特性。首先将传感器于浸泡液中稳定90 s 进行初步清洗以除去膜表面杂质，其中鲜、咸、酸传感器使用阴离子浸泡液（0.1 M HCl+300 mL 无水乙醇），甜、苦传感器使用阳离子浸泡液（0.1 M KCl+10 mM KOH+300 mL 无水乙醇），然后将各传感器于基准液中分别清洗2 min，即可用来测定样品的电子舌评分。公式如下：

式中：V：电势差输出值，即为电子舌评分；Vs：传感器在样品溶液中稳定30 s 测得的电势值；Vr：传感器在基准液中稳定30 s 测得的电势值。

1.3.4 合成肽的基本呈味特性评价

参照李露芳等[16]的方法，利用电子舌对合成肽的滋味进行评价分析。用超纯水配置1 mg/mL 的合成肽样品，置于电子舌样品盘中，于室温条件下进行数据采集，每个样品每次数据采集时间为2 min，共采集4次，每个样品数据采集完后，探头需用味觉标准溶液和洗脱剂进行两步清洗干净后才能进行下一个样品的测定。评价指标包括酸、甜、苦、咸、鲜味，其标准品分别是0.03 mg/mL 的柠檬酸、300 mg/mL 的蔗糖、0.03 mg/mL 的咖啡因、1 mg/mL 的食盐和1 mg/mL的味精。

1.3.5 合成肽对MSG 的增鲜效果评价

以1 mg/mL 的MSG 作为鲜味标准品，向100 mL的1 mg/mL MSG 溶液中加入100 mg 合成肽，鲜味的评价方法同1.3.4。

1.3.6 合成肽对酱油的增鲜效果评价

以稀释30 倍的酱油作为标准品，向100 mL 稀释30 倍的酱油溶液中加入100 mg 合成肽，鲜味的评价方法同1.3.4。

1.3.7 合成肽的美拉德反应

精确称取100 mg 合成肽和100 mg 葡萄糖加入到100 mL 超纯水中，置于95 ℃的磁力搅拌加热器中反应30 min，室温冷却得到美拉德反应产物。

1.3.8 数据分析

所有测试均重复三次，单因素方差分析采用SPSS 14.0 软件的one-way ANOVA（SPSS Inc., Chicago, IL,USA）统计分析软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 不同氨基酸序列合成肽的呈味特性

经HPLC 检测，十二条合成肽的纯度均大于95%，满足实验要求。首先采用电子舌测定了Asn-Pro、Pro-Asn、Ala-His 和His-Ala 四条肽的基本滋味以及对MSG 和酱油的增鲜效果。由表1 可知，相比于Asn-Pro，Pro-Asn 的酸、苦味上升明显，而甜、咸和鲜味下降明显，其中酸味评分提高了19.26 分，咸味评分降低了31.03 分，变化幅度较大；相比于Ala-His，His-Ala 酸、咸和鲜味上升明显，而甜、苦味下降明显，其中咸味评分提高了12.14 分，甜味评分降低了13.53分。同样地，肽对MSG 和酱油的增鲜效果可由鲜味评分体现，由图1a 和图1b 可知，Asn-Pro 对MSG 和酱油具有明显的增鲜作用，其鲜味评分分别为11.75分和11.96 分（MSG 和酱油标准品的鲜味评分分别为9.97 分和11.29 分），而Pro-Asn 对MSG 和酱油具有明显的抑鲜作用，其鲜味评分分别为8.57 分和10.27分；Ala-His 和His-Ala 仅对MSG 的增鲜效果上存在显著性差异，鲜味评分分别为10.50 分和11.37 分，结果表明其中His-Ala 增鲜作用更强，但两者对酱油的增鲜效果差异较小，鲜味评分分别为11.47 分和11.77 分。

图1 不同氨基酸序列合成肽对MSG（a）和酱油（b）增鲜效果电子舌评分图Fig.1 Electronic tongue score of umami-enhancing effect of synthetic peptides composed by different amino acid sequence on MSG (a) and soy sauce (b)

表1 不同氨基酸序列合成肽的电子舌评分表Table 1 Electronic tongue score of synthetic peptides composed by different amino acid sequences

表2 不同鲜味氨基酸组成的合成肽电子舌评分表Table 2 Electronic tongue score of synthetic peptides composed by different umami amino acids

类似的有，Tamura 等[17]研究发现Orn-Asp、Lys-Asp、Orn-Glu 和Lys-Glu 几乎无味，而Asp-Orn和Asp-Lys 具有酸味，Glu-Orn 和Glu-Lys 却具有显著的鲜味和酸味。研究表明氨基酸序列与呈味肽的鲜味强度密切相关，鲜味肽的鲜味来源于酸性基团与碱性基团的相互作用，只有这两种基团的处于合适位置时才会使人感受到鲜味[18]，这说明氨基酸序列的不同对鲜味肽的呈味特性具有重要影响。

2.2 不同鲜味氨基酸组成的合成肽的呈味特性

由表2 可知，在Asn-Pro 两端分别引入鲜味氨基酸（Glu 和Asp）后，Glu-Asn-Pro、Asn-Pro-Glu、Asp-Asn-Pro 和Asn-Pro-Asp 相比于Asn-Pro 酸味明显，酸味评分分别提高了32.16 分、32.24 分、21.81分和32.71 分，而甜味和鲜味较弱，甜味评分分别降低了15.38 分、14.38 分、4.75 分和15.37 分，鲜味评分分别降低了4.69 分、4.88 分、7.85 分和4.98 分。值得注意的是，Glu-Asn-Pro、Asn-Pro-Glu 和Asn-Pro-Asp三条肽在酸、甜、苦、咸和鲜味评分上较为接近，而Asp-Asn-Pro 与这三条肽的呈味特性差异较大。同时由图2a 和b 可知，Glu-Asn-Pro、Asn-Pro-Glu、Asp-Asn-Pro、Asn-Pro-Asp 对MSG 和酱油的鲜味均具有明显的抑制作用，使得MSG 鲜味评分分别降低了4.92 分、4.64 分、5.19 分和4.04 分以及酱油鲜味评分分别降低了3.21 分、2.99 分、3.35 分和2.51 分，只有Asn-Pro 能显著地提升MSG 和酱油的鲜味。

图2 不同鲜味氨基酸组成的合成肽对MSG（a）和酱油（b）增鲜效果电子舌评分图Fig.2 Electronic tongue score of umami-enhancing effect of synthetic peptides composed by different umami amino acids on MSG (a) and soy sauce (b)

目前研究发现的鲜味肽一般具有鲜味氨基酸（Asp 和Glu）的一种或两种[19]，如Noguchi 等[20]从鱼肉蛋白中分离得到多条含有 Glu 的鲜味肽（Thr-Glu、Glu-Glu、Glu-Asp、Glu-Asp-Glu 和Glu-Gln-Glu）；Matsushita 等[21]从啤酒酵母调味料中分离得到由4 个Asp 组成的鲜味肽Asp-Asp-Asp-Asp；Schlichtherle-Cerny 等[22]从小麦面筋蛋白酶解产物中分离得到四条具有鲜味的焦谷氨酸的寡肽，分别为pGlu-Pro、pGlu-Pro-Gln、pGlu-Pro-Ser和pGlu-Pro-Glu。但也有学者研究发现具有鲜味氨基酸（Asp 和Glu）的肽并不一定具有鲜味，如 Kim 等[23]发现Glu-Gln-Pro-Gln-Gln-Asn-Glu 和Asn-Asn-Glu-Asp-Thr呈现出明显的苦味；Cho 等[24]发现Glu-Tyr-Phe-Leu和Phe-Ile-Glu-Gly-Val 苦味较为突出；宋雪梅等[25]在干 酪 中 分 离 出 多 条 苦 味 肽 ， 如His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu 和Ser-Asp-Ile-Pro-Asn-Pro-Ile-Gly-Ser-Glu-Asn-Ser-Gly 等均含有鲜味氨基酸但无鲜味。此外，也有研究报道了不含鲜味氨基酸（Asp 和 Glu）但具有显著鲜味的多肽，如Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val 、 Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr[26]、Val-Pro-Tyr、Thr-Ala-Tyr、Ala-Ala-Pro-Tyr、Gly-Phe-Pro[27]和Tyr-Gly-Gly-Thr- Pro-Pro-Phe-Val[28]。

本研究中Glu-Asn-Pro、Asn-Pro-Glu、Asp-Asn-Pro、Asn-Pro-Asp 与Asn-Pro 的呈味特性存在极大差异的原因可能与寡肽存在空间构效有关，肽链的长度会导致结构和电荷分布的差异，从而影响呈味肽的呈味特性，如Yu 等[29]通过构建3D-QSAR 模型研究鲜味六肽与受体间的相互作用表明，在特定区域引入适当电荷和适当大小的基团可能会改善六肽的鲜味特性；Dang 等[30]研究发现只有当鲜味肽的带正电基团、带负电基团以及疏水性基团分别连接到相对应的鲜味受体上，才能使人感受到鲜味。该研究提示Glu 和Asp 残基对多肽呈鲜与增鲜特性可能存在抑制效应。

2.3 不同Asn-Pro和Ala-His串联肽的呈味特性

图3 不同Asn-Pro 和Ala-His 串联肽对MSG（a）和酱油（b）增鲜效果电子舌评分图Fig.3 Electronic tongue score of umami-enhancing effect of synthetic peptides composed by Asn-Pro and Ala-His on MSG(a) and soy sauce (b)

由表3 可知，相比于Ala-His 和Asn-Pro，Ala-His-Ala-His、Asn-Pro-Asn-Pro、Ala-His-Asn-Pro和Asn-Pro-Ala-His 四条肽酸味明显，酸味评分分别为0.11 分、2.43 分、0.81 分和1.02 分，而甜味较弱，甜味评分分别为-5.51 分、-5.39 分、-4.06 分和-4.42 分，同时苦味和鲜味均有所降低。值得注意的是，Ala-His-Asn-Pro 和Asn-Pro-Ala-His 咸、鲜味差异较小，但酸、甜和苦味具有显著性差异；而Ala-His-Ala-His 和Ala-His，以及Asn-Pro-Asn-Pro 和Asn-Pro 之间酸、甜、苦、咸和鲜味差异明显。同时由图3a 和b 可知，Ala-His-Ala-His、Asn-Pro-Asn-Pro、Ala-His-Asn-Pro、Asn-Pro-Ala-His 对MSG 和酱油的鲜味均具有明显的抑制作用，其中Asn-Pro-Asn-Pro的抑鲜作用最强，分别使得MSG 和酱油的鲜味评分降低了1.74 分和2.38 分。

有文献报道Asp-Asp[31]和Asp-Asp-Asp-Asp[21]之间、Gly-Gly[23]、Gly-Glu[32]和Gly-Gly-Gly-Glu[33]之间的呈味也存在巨大差异。一方面，鲜味肽的肽链长度在一定程度上影响着其鲜味强度，鲜味肽氨基酸骨架一般结构式为-O)(C)n(O-，n 介于3～9 之间，当n 取值为4～6 之间时鲜味最强，因此随着分子量的增加，碳链的延长，导致合成肽的鲜味下降，这是Ala-His-Ala-His 和Ala-His 以及Asn-Pro-Asn-Pro 和Asn-Pro 呈味特性之间存在巨大差异的重要原因；另一方面，当氨基酸组成相同时，改变肽的序列，如氨基酸在肽链中的位置，也会引起呈味性质的改变[18]，造成Asn-Pro-Ala-His 和Asn-Pro-Ala-His 之间呈味特性存在差异。

表3 不同Asn-Pro 和Ala-His 串联肽电子舌评分表Table 3 Electronic tongue score of synthetic peptides composed byAsn-Pro and Ala-His

表4 合成肽美拉德反应物的电子舌评分表Table 4 Electronic tongue score of synthetic peptide Maillard products

2.4 Asn-Pro 和Ala-His 美拉德反应产物的呈味特性

由表4 可知，Asn-Pro 和Ala-His 与葡萄糖发生美拉德反应后，其美拉德反应产物酸味和鲜味明显增强，其中酸味分别上升34.91 分和19.50 分，鲜味分别提高了1.83 分和2.28 分，而甜味与苦味明显减弱，甜味分别降低了17.33 分和25.31 分，苦味分别降低了4.56 分和4.15 分。由图4a 和b 可知，在对MSG和酱油的增鲜效果上，Asn-Pro 和Ala-His 的美拉德产物增鲜效果也比Asn-Pro 和Ala-His 强，其中Asn-Pro的美拉德产物分别使MSG 和酱油的鲜味评分提高了3.96 分和3.77 分，Ala-His 的美拉德产物分别使MSG和酱油的鲜味评分提高了2.29 分和1.49 分。

由于Asn-Pro 和Ala-His 的氨基和葡萄糖的羰基在高温下会发生亲核加成生成席夫碱，然后经不同途径降解生成具有特殊滋味的化合物，从而影响美拉德反应产物滋味。有研究表明，在美拉德反应过程中，氨基和羰基会发生缩合反应，脱去一分子水生成Schiff 碱，随后发生环化生成N-糖基胺，并发生Amadoria 重排。Amadoria 重排产物一方面可经2,3-烯醇化反应，生成还原酮类如二氢呋喃等，还原酮脱氢后可生成脱氢还原酮，酮类在一定条件下反应可生成醛类；另一方面，Amadoria 产物可裂解生成酮、酮醇、酮醛等产物，裂解产物中的α-二羰基化合物可以和α-氨基酸反应，发生Strecker 降解，形成α-氨基酮和醛类，其中许多酮醛类等化合物是许多风味物质前体[34]。

图4 合成肽美拉德反应物对MSG（a）和酱油（b）增效效果电子舌评分图Fig.4 Electronic tongue score of umami-enhancing effect of synthetic peptide Maillard products on MSG (a) and soy sauce(b)

3 结论

本文对比分析了不同结构改性和美拉德反应对鲜味二肽（Asn-Pro 和Ala-His）的鲜味强度以及对MSG 和酱油的增鲜效果的影响。不同结构改性结果表明，氨基酸顺序改变后，Asn-Pro 和Ala-His 呈味特性显著改变，其中Pro-Asn 较Asn-Pro 鲜味降低，对MSG和酱油的鲜味具有抑制作用；而His-Ala 较Ala-His鲜味增加，对MSG 和酱油具有更好的增鲜效果。在Asn-Pro 两端增加鲜味氨基酸（Glu 和Asp），获得的三肽（Glu-Asn-Pro、Asn-Pro-Glu、Asp-Asn-Pro 和Asn-Pro-Asp）的鲜味显著降低，对MSG 和酱油具有明显的抑制鲜味作用。Asn-Pro 和Ala-His 相互串联获得的四肽（Ala-His-Ala-His、Asn-Pro-Asn-Pro、Ala-His-Asn-Pro 和Asn-Pro-Ala-His）降低了原二肽的鲜味，对MSG 和酱油具有明显的抑制鲜味作用。该研究为鲜味肽构效关系研究提供了样本。美拉德反应结果表明，Asn-Pro 和Ala-His 与葡萄糖进行美拉德反应后能显著提高其鲜味，且能明显提升MSG 和酱油的鲜味。因此美拉德反应是较好地提升多肽鲜味与增鲜效果的策略。