精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏效果的影响分析

陈晓文 郑文玲 梁光林 李永强 杨文滔

摘要：目的：探讨精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏效果的影响。方法：选择2019年1月至2020年12月于茂名市人民医院生殖中心就诊并进行人类辅助生殖技术（ART）治疗的80例男性患者的精液标本，每份标本等分4份，以原液作为对照（A组），其他三组分别采取不同方法处理，B组采取洗涤法，C组采取上游法，D组采取密度梯度离心法，之后进行精子冷冻复苏。比较四组精子总数、前向运动精子活率、膜完整率、DNA完整率，比较四组精子低活力与正常活力的精子冷冻复苏率。结果：四组标本优化前精子总数、膜完整率、DNA完整率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;复苏后，四组精子总数均降低，C组、D组低于A组、B组，且B组、C组、D组膜完整率、DNA完整率均升高并高于A组，同时C组、D组高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。80份标本中精子低活力20份，正常活力60份。A组精子冷冻复苏率最高，C组、D组稍低，但C组与A组、D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;D组精子冷冻复苏率低于A组，B组低于A组、C组、D组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：不同精液冷冻前优化处理方式均会降低精子总数及前向运动精子活率，但可提高细胞膜完整率及DNA完整率，其中洗涤法明显降低精子冷冻复苏率，而上游法优化效果好但回收率低，密度梯度离心法回收率高但优化效果一般，应根据实际情况选择适宜的处理方式。

关键词：精液冷冻;洗涤法;上游法;密度梯度离心法;精子冷冻复苏率;精子总数;精子活力指数

自精保存即将精子进行低温冷冻，是人类辅助生殖技术（ART）的重要组成部分，为患者进行ART前提供了精子解决方案。考虑到男性不育患者多因为年龄、环境污染物、重金属、致癌物、生殖系统疾病等因素导致精子细胞、DNA完整性受到影响，因此需对精液进行优化处理，去除大部分非精子物质，获得活力与形态更好的精子，利于供精人工授精（AID）和供精体外受精（IVF-D）治疗[1]。洗涤法、上游法、密度梯度离心法为常用的精子优化处理方法，各自具有一定优势，因此需明确不同方法对活力精子的影响，选择最佳的优化处理方案[2]。本研究主要探讨精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏效果的影响。现报道如下：

1资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月至2020年12月于茂名市人民医院生殖中心就诊并进行ART治疗的80例男性患者的精液标本。按照《人类精液检查与处理实验室手册》标准进行精液筛查，符合液化正常，精液量≥2.0 ml，精子浓度为（70～200）×106/ml，正常形态≥4%标准[3]。每份标本等分4份。

1.2 研究方法

所有患者均禁欲2～7 d，在专用取精室用无菌取精杯取精，置入37℃水浴箱内液化。每份精液标本充分混匀后，分别取0.5 ml进行冷冻，将梯度离心培养液ART-8022按1：1体积比例添加至各组精子悬液，4℃冷冻15 min，悬挂液氮上方10 cm冷冻15 min，最后置入液氮中。冷冻前优化处理方式如下：A组原液直接进入冷冻步骤;B组采用洗涤法，加入1 ml精子洗涤培养液ART-1006，离心处理，去除上清液，加入ART-1006重悬精子沉淀直至0.5 ml后备用;C组采用上游法，缓慢加入1.2倍ART-1006，倾斜45°，置入37℃培养箱内孵育30 min，取上层液离心处理，去除上清液，加入ART-1006重悬精子沉淀直至0.5 ml后备用;D组采用密度梯度离心法，无菌锥形离心管中用梯度离心培养液ART-2024制备密度梯度液，上层和下层分别0.5 ml 40% Isolate、0.5 ml 80% Isolate，将标本加入上层液，离心处理，去除上清液，加入ART-1006，离心处理，去除上清液，加入ART-1006重悬精子沉淀直至0.5 ml后备用。冷冻1周后，取出置于37℃水浴箱里10 min，充分混匀后进行分析。

1.3 观察指标

比较四组精子总数、膜完整率、DNA完整率。比较四组精子低活力（PR≤32%）与正常活力（PR>32%）的精子冷冻复苏率（复苏后PR精子百分率/优化前PR精子百分率）。

1.4 统计学处理

使用SPSS22.0版本软件分析数据，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料用率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 四组精子数量及形态学比较

四组标本优化前精子总数、膜完整率、DNA完整率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;复苏后，四组精子总数均降低，C组、D组低于A组、B组，且B組、C组、D组膜完整率、DNA完整率均升高并高于A组，同时C组、D组高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 四组精子冷冻复苏率比较

80份标本中精子低活力20份，正常活力60份。A组精子冷冻复苏率最高，C组、D组稍低，但C组与A组、D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;D组精子冷冻复苏率低于A组，B组低于A组、C组、D组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3讨论

随着医疗技术的进步，治疗不孕不育症的方法越来越先进。近年来我国男性不育发生率逐渐提高，针对男性不育的ART受到重视，如AID和IVF-D。精液优化处理为去除精液杂质、碎片，保证获得高前向运动精子、细胞完整及DNA完整的精子悬液的方法[4～7]。洗涤法具有操作简单、效率高的优势，但优化效果差，基本与原液一致，甚至精子活力降低。上游法主要依据精子的活力进行优化，精子损伤轻，优化效果好，但耗时长，精子回收率低。密度梯度离心法可促使精液中的各种成分达到平衡，分离出正常的精子，精子损伤轻，优化效果好，但操作中多次离心，也会对精子造成一定损伤。本研究结果显示，复苏后四组精子总数以A组最高，C组最低，且C组、D组膜完整率、DNA完整率显著高于A组、B组，证实原液和洗涤法虽然可保证冷冻后足够的精子总数，但精子细胞组膜完整率和DNA完整率降低，而上游法、密度梯度离心法可获取活力与形态更好的精子，但精子总数降低，尤其上游法大幅降低死精子。A组精子冷冻复苏率最高，C组、D组稍低，而且D组精子冷冻复苏率显著低于A组，B组显著低于A组、C组、D组，与梅凤琦[8]结果“精子冷冻复苏率由高至低排序为A组>C组>D组>B组，B组和D组精子冷冻复苏率均显著低于A组”相近，均证实上游法可获得与原液基本一致的精子冷冻复苏效果，密度梯度离心法效果相对较差，但也可保证较好的复苏效果。洗涤法的精子冷冻复苏效果不佳，可能与其操作中去除精浆有关，导致精子抗活性氧能力减弱，因此除非精子浓度很低，需要足够的精子总数，否则需采取其他方法。需注意，虽然上游法、密度梯度离心法可提高复苏后的精子活力，但上游法应用存在限制，精子总数降低过多，若为低活力且低浓度的标本，难以获得足够的精子总数，无法完成IUI/IVF技术[9]。

综上所述，精液冷冻前采取上游法、密度梯度离心法可获得较好的精子冷冻复苏效果，提高精子细胞膜完整率及DNA完整率，应依据实际情况选择。

参考文献

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[2]陈娟，耿琳琳，卢文红，等.四种精液处理方法优选冷冻精子的比较[J].生殖医学杂志，2019，28（6）：667-672.

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[7]房芃，赵秀红，王洪霞，等.自制金属冷冻板法冷冻人附睾精子的实验研究[J].中华男科学杂志，2019，25（7）：586-589.

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[9]欧展辉，陈志恒，王慧，等.不同的精液处理方法对体外受精IVF周期结局的影响[J].中国优生与遗传杂志，2017，25（10）：120-121.