利用N糖苷酶F对单克隆抗体N糖酶解条件的优化

张博慧, 贾戴辉, 程倩, 许俊彦, 邵喆, 黄应峰

宝船生物医药科技(上海)有限公司药物分析部门, 上海 201203

N糖基化修饰是单克隆抗体药物普遍存在的翻译后修饰现象。目前研究表明，糖基化修饰与单克隆抗体药物的功能、药物代谢、免疫原性等关系密切[1-3]，如核心岩藻糖缺失能显著增强ADCC效应[4]，半乳糖能够增强CDC活性[5]；末端N-乙酰葡萄糖影响抗体药物半衰期[6-7]；唾液酸化糖型具有抗炎症功能[8]；α(1-3)半乳糖和NGNA型唾液酸易引起免疫原性[9]等。N糖对抗体结构也具有重要作用，能稳定CH2结构域，去糖抗体稳定性会变差，更易发生去折叠和聚集[10]。

N糖类型和含量受细胞株、培养条件、纯化和储存[11-13]等过程的影响，因此在单抗药物细胞筛选、工艺优化、纯化、产品放行和稳定性考察中控制和监测N糖含量，保证单抗药物安全性、有效性等尤为重要。目前检测N糖的方法主要有亲水色谱-荧光法[14]、CE-LIF法[15-16]和质谱法[17-18]等。其中亲水色谱-荧光法是目前应用最为广泛的方法，该方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的N糖链，再用标记试剂进行衍生化，采用亲水色谱柱分离，荧光检测器检测。由于PNGase F几乎能水解所有哺乳动物细胞产生的N糖，因此得到广泛应用[19]。传统的N糖谱检测方法一般耗时较长，目前快速N糖样品制备的试剂盒已经商品化，大幅提高了N糖的检测效率，但是通常价格昂贵。而应用快速PNGase F酶与传统制备过程相组合成为提高检测效率和降低检测成本的一种选择。本研究基于亲水色谱-荧光法，针对PNGase F水解条件进行了优化，发现和解决了酶解过程中易对结果产生影响的一些因素，建立了高效准确的N糖检测方法，以期为N糖的检测研究提供参考。……