杂交水稻种子SSR分子标记纯度鉴定

2021-03-30 05:43刘奇燕丁显萍张萍
安徽农学通报 2021年5期

刘奇燕 丁显萍 张萍

摘 要:该研究优化了SDS的DNA提取方法,采用SSR分子标记技术建立了一种准确、稳定、快捷、规模化的杂交水稻种子纯度检测流程,为大规模杂交水稻种子纯度检测提供了高效简便的方法。

关键词:纯度鉴定;水稻品种;SSR分子标记

中图分类号 S511    文献标识码 A文章编号 1007-7731(2021)05-0009-02

种子质量不仅是决定农作物收成的关键,也是种业企业在竞争中处于不败之地的重要因素,是种业企业生存的根本。杂交种子纯度是种子质量检测的重要指标之一,加强种子纯度检测对于水稻生产销售至关重要。种子纯度检测主要有海南鉴定、正季种植鉴定以及SSR分子标记鉴定方法。海南鉴定具有相对准确、时间相对提前的优点,但海南冬季属短日照低温条件,感光类型及两系不育系均表现为正常结实,对杂交水稻尤其是两系杂交水稻种子纯度的鉴定结果往往失真。正季鉴定结果与大田生产实际吻合度高的优点,但时间明显滞后。从历年发生的重大种子纯度事故来看,绝大多数是在得知种子纯度不合格之前,种子已经销售到千家万户无法召回,从而酿成了无法挽回的损失。SSR分子标记是从DNA水平上检测生物个体差异,具有多态性高、谱带扩增稳定、技术成熟、检测时间短、不受环境影响等特点,在杂交水稻种子纯度鉴定中得到了越来越广泛的应用。为此,本研究建立了一种准确、稳定、快捷、规模化检测的流程,为大量检测杂交水稻种子纯度提供高效简便的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 48对引物,Taq DNA聚合酶,DNTP,十二烷基磺酸钠,10%SDS,2MTris-HCI,250mMEDTA,乙酸铵,40%聚丙烯酰胺凝胶,5*TBE,过硫酸铵,四甲基乙二胺,甲醛,冰醋酸,无水乙醇,氢氧化钠,硝酸银,琼脂糖,溴酚蓝等化学试剂。

1.1.2 主要仪器 研磨仪,高速冷冻离心机,水浴锅,PCR扩增仪,电泳仪,电泳槽,摇床,胶片观察灯,通风橱,超低温冰箱,微波炉,电子天平等仪器。

1.2 方法

1.2.1 种子发芽 每个样品随机取300粒种子,均匀置于发芽床上,放在30℃的发芽箱6d左右。

1.2.2 DNA提取(一种优化的SDS提取法) 随机选取水稻幼苗用镊子放入96孔深孔板中,每个单株在1~5cm,将磁珠放入每个孔中,盖上软盖,做好标记,放入超低温冰箱冷冻1h左右。冷冻结束放在研磨仪研磨1min30s,用高速冷冻离心机离心2min。每个孔中加入280μL的65℃提取液,再用研磨仪研磨30s,离心机离心2min。加入150μL的乙酸铵溶液,充分摇匀,4000r、4℃冷冻离心机离心15min。将上清液200μL转入另一深孔板中,加入400μL的无水乙醇。4000r、4℃冷冻离心机离心15min,弃上清,自然条件下干燥或用吹风机吹干,加入100μL的双蒸水,放置4℃冰箱保存备用。

1.2.3 引物筛选 采用中华人民共和国农业行业标准NY/T1433—2014《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》附录C中推荐的48对SSR引物,对杂交种进行多态性筛选。选用在杂交种中具有较好多态性的SSR引物。

1.2.4 PCR扩增检测 从筛选得到的引物中随机挑选2对引物进行PCR扩增,采用11μL的PCR反应体系,即在PCR反应管中分别加入样品DNA提取液(2.0μL)、10×Buffer(1.0μL)、2.5mMNTP(0.8μL)、25mMMgcl2(0.6μL)正向引物(1μL),反向引物(1μL)、ddH2O(4.35μL)和TaqDNA聚合酶(0.25μL)。PCR反应程序为:先94℃预变性2min;再94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸8min。反应完成后,加入溴酚蓝,置4°C环境下保存备用。

1.2.5 PCR产物检测 扩增产物采用3%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测,使用104孔密型点样梳一次性点样96孔PCR板上的96个样品;在350V、400mA条件下,电泳40min,染色、显影。

2 结果与分析

2.1 判别方法 每个品种用2对引物扩增,分别做96粒,点样时一一对应。如果2对引物都在同一个位置上检测到杂株,则判断为1个杂株;如果2对引物分别在不同位置检测到杂株,检测到几个杂株则判断为几个个杂株。如果其中1对引物在某个位置上检测到亲本带,而另一对引物在这个位置上没有检测到亲本带,则判断为杂株;如果2对引物都在这个位置上检测到亲本带且都是母本带或者都是父本带,则判断为杂母本或者父本。

2.2 纯度判定 图1为品种A在标记RM336和标记RM208第6位置上是都是母本带,则判断品种A杂1粒母本带,纯度为99.0%。2为品种B在标记RM71上第21位置上是母本带;在标记RM339上12位置上是母本带,27位置上是母本带,43位置上是杂株,则判断品种B有4个杂株,纯度为95.8%。

3 讨论

在常规的SSR分子标记检测程序中,DNA提取通常采用的是CTAB法、没有优化的SDS法、快提法和磁珠法。CTAB法和普通的SDS法需要加氯仿和异戊醇,气味很难闻,对人体有害、不安全,快提法DNA的质量不高,且保存时间很短,对PCR扩增产物检测电泳有限制,如毛细管电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测效果不好。磁珠法提取成本高,试剂盒比较贵。本研究优化的SDS法,无需加氯仿和异戊醇,比较安全,提取的DNA质量高,保存时间很长,适合任何电泳,成本低,经济适用。并且用深孔板提取,能够高通量提取,特别是需要大量提取水稻DNA时,优势明显。

引物选择上原则是选择杂合率高,在其双亲中具有共显性的多态性,区分异品种能力强,多态性好,扩增效果好,即可用于杂交种子的纯度检测。但不同SSR引物的杂株辨别率的差距较大,单对SSR引物检测杂株类型构成复杂的样品时可靠性较低。所以应尽可能了解受检样品的生产背景和杂株类型,最好与田间鉴定相结合,选出具有针对性的2对或多对引物供检测。

参考文献

[1]周桂林,刘奇燕,范家萌,等.SSR分子标记高效選择抗稻瘟病双基因Pi-1、Pi-2的技术体系[J].安徽农业科学,2017(7):123-125.

[2]李婧婧,付求来,戴继侠,等.一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法[J].种子,2018(4):125-126,131.

(责编:张宏民)