酶解结合高剪切破壁技术对蜂花粉酚类物质及抗氧化活性的影响

王 悦，徐元元，杨二林，程 妮,3※

（1. 西北大学化工学院，西安 710069；2. 西北大学食品科学与工程学院，西安 710069；3. 陕西省蜂产品工程技术研究中心， 西安 710065）

0 引言

蜂花粉是由蜜蜂采集被子植物雄蕊花药或裸子植物小孢子囊内的花粉细胞，并混入花蜜及自身分泌物而形成团粒状物[1]。蜂花粉作为一种保健食品，具有治疗特性，蜂花粉中约70%的物质具有生物活性，具有抗氧化、保护肝脏、抗炎、抗菌和抗癌作用[2-4]。其中多酚类物质表现出强抗氧化活性[5]，可以有效清除自由基，保护机体免受活性氧的损伤，同时增强血管活性，从而改善血液循环和心脏功能。酚类物质可促进改变膜的通透性，破坏细菌的遗传物质达到抑菌效果，特别是对病原菌化脓性链球菌有显著的抗菌效果[6]，酚类物质是蜂花粉主要的抑菌剂，总酚含量同革兰氏细菌生长数量呈负相关[7]。酚类物质还有抑制肿瘤细胞的作用，阻断肿瘤细胞特定基因的表达，同时增强免疫系统[8]。但蜂花粉外壁主要由纤维素和孢粉素构成，具有抗酸、耐碱、抗微生物分解的特性，不经破壁，酚类物质很难溶出，只能从萌发孔中缓慢释放，体外抗氧化活性很低，不利于开发用于外用的护肤品及药品。此外坚硬的花粉壁使得蜂花粉在生物体内消化率不高，吴伟[9]通过小鼠体内消化试验表明破壁蜂花粉在小鼠胃部更容易排空，荧光显微镜观察消化2 h和12 h后的蜂花粉形态，发现破壁蜂花粉碎片并无变化，未破壁蜂花粉粉粒依旧完整，表明蜂花粉外壳并不受消化酶影响，意味着大部分营养物质不能够被胃肠消化。未破壁蜂花粉在生物体内消化率只有52%～59%，导致营养成分浪费，因此蜂花粉破壁有助于对提高蜂花粉活性物质溶出，提高体内外利用度[10-12]。

花粉破壁是指在外力作用下破坏花粉壁结构，破壁后内容物溶出，有助于提高生物活性。吴伟[9]研究表明，破壁后蜂花粉总黄酮、总酚溶出率显著增加（P＜0.001）。赵萌萌等[13]对青稞麸皮超微破壁后，抗氧化活性均有显著提高（P＜0.05）。目前主要采用机械破壁、温差破壁、酶解以及微生物发酵等破壁方法。机械破壁法时间作用长可能导致原料温度过高，破坏营养成分；温差破壁法成本过高，时间过长；酶解破壁与微生物发酵法等生物破壁法，成本较高、时间过长，大量使用使样品污染的可能性增大[14]。由于蜂花粉外壁主要由纤维素和孢粉素构成，且为了克服单一破壁方法的弊端，故本研究采用纤维素酶酶解结合高剪切方法进行复合法破壁，提高生物利用度，降低成本的同时不破坏营养成分。且目前对于蜂花粉破壁研究多集中于破壁后形态表征以及对总酚、总黄酮含量影响，而破壁对蜂花粉酚类物质的溶出情况、抗氧化活性及对·OH介导的质粒DNA氧化损伤的保护作用的影响研究甚少。

本文以荷花、枣花、茶花、油菜、玫瑰和五味子6种蜂花粉等为研究对象，采用酶解联合高剪切破壁技术，研究破壁对蜂花粉酚类物质和抗氧化活性的影响。同时探讨破壁前后蜂花粉对·OH介导的质粒DNA链氧化损伤的保护作用，以期为蜂花粉资源的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荷花、枣花、茶花、油菜、玫瑰、五味子6种蜂花粉均直接从蜂农处采购，且植物源经过孢粉学鉴定[15]，确认每种蜂花粉的种类。

菲洛嗪（Ferrozine）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、水溶性维生素E（Trolox）、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）和酚类标准品（没食子酸、对羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、芦丁、鞣花酸、肉桂酸、槲皮素、柚皮素、山奈酚、异甘草素）购自美国Sigma公司；色谱级甲醇购自上海安谱实验科技股份有限公司；过氧化氢（H2O2）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自科昊生物工程有限公司；纤维素酶（酶活力为400 U/mg）购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 蜂花粉破壁工艺

1.2.1 纤维素酶酶解破壁

参考并优化孟良玉等[16]的方法，分别称取0.5 g蜂花粉，置于15 mL离心管中，添加质量分数为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%纤维素酶，料液比为1∶10 g/mL，50 ℃恒温水浴摇床酶解5 h。酶解结束后，80 ℃水浴灭酶10 min。吸取破壁蜂花粉悬浊液1 mL，蒸馏水定容到10 mL，取1～2滴稀释液于载玻片上，置于20×20目（放大倍数：400×）荧光显微镜下观察，取九宫格视野，计算破壁率。

1.2.2 纤维素酶酶解-高剪切联用破壁

参考王凯[17]的方法，采用D-500均质机（德国Wiggens公司）将酶解过的蜂花粉悬浊液高剪切30 s，转速10000～15000 r/min，根据1.2.1节方法计算破壁率。

1.3 蜂花粉酚类物质富集

为了保证试验统一性，6种花粉均称取20 g，用体积分数为75%的乙醇、料液比1∶20 g/mL（破壁蜂花粉酚类物质富集：称取20 g蜂花粉，按照料液比1∶10 g/mL酶解后，将酶解液低温旋转蒸发至一定量，加入无水乙醇配制成体积分数为75%的乙醇溶液，按照1∶20 g/mL料液比添加到破壁蜂花粉渣中）热回流2 h，三次回流，浓缩，采用体积分数为75%的乙醇定容至15 mL，备用。

1.4 HPLC分析6种蜂花粉破壁前后乙醇提取物酚类化合物

采用高效液相色谱-二极管列阵检测（High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detection，HPLC-DAD）法测定蜂花粉酚类化合物含量[18]。HPLC-DAD（U3000 HPLC， G1315A DAD，美国Thermo公司），色谱柱 Zorbax SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5.0μm）；流动相：甲醇（A）、体积分数为0.1%的甲酸（B）；梯度洗脱程序为：0～5 min，15%A+85%B；5～10 min，17%A+83%B；10～25 min，30%A+70%B；25～35 min，40%A+60%B；35～40 min，50%A+50%B；40～55 min，55%A+45%B；55～65 min，60%A+40%B；65～70 min，65%A+35%B；70～75 min，70%A+30%B。流速为1.0 mL/min，进样量是10μL蜂花粉乙醇提取物，二极管阵列检测器（DAD）检测波长：254、280、290、324 nm；柱温是30 ℃。

1.5 总酚含量测定

参照Sfifzadeh等[19]方法，采用Folin-Ciocalteu法测定6种蜂花粉破壁前后的总酚含量，以表示酚类物质的溶出量。吸取0.3 mL方法1.3节中蜂花粉乙醇提取液定容到200 mL。准确吸取1 mL蜂花粉乙醇提取稀释液，加入1 mL福林酚试剂、5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，用蒸馏水定容到10 mL，振荡混匀后，避光反应1 h。760 nm处，以蒸馏水为参比，测吸光度值，总酚含量以没食子酸当量（Gallic Acid Equivalents，GAE）mg/g表示。

1.6 总黄酮含量测定

参照张翠香等[20]方法，采用Al(NO3)3比色法测定6种蜂花粉破壁前后的总黄酮含量，以表示黄酮类物质的溶出量。吸取0.3 mL蜂花粉乙醇提取液定容到10 mL。吸取1 mL蜂花粉乙醇提取稀释液，加0.4 mL 5 g/mL的NaNO2，反应6 min后，加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3，反应6 min后，加入4 mL 4%的NaOH溶液，用80%的甲醇溶液定容到10 mL，静置15 min。于510 nm处测定其吸光度值，总黄酮含量以芦丁当量（Rutin Equivalents，RE）mg /g表示。

前一阵，朋友让我帮忙买点奔富，我问他：“奔富有很多个系列，你要的是哪款？”他一下也愣了，对于只是日常商务应酬需要的他，对品牌并不太了解。日理万机的他，常常喝到喜欢的，就发个照片来，找朋友帮忙买点。记得有次去参观他新换的写字楼，办公室里新添了酒柜，我打趣他：“不错嘛，终于开始备起来了！”他笑。过去，他们常常是有需要，直接让员工去弄现成的，如今也开始懂得囤上一些，一到饭局，顺手带上一两支。因为多年的好友无所顾忌，我直接打开酒柜，想看看他都囤了哪些好东西。结果一打开就看到了奔富的红帽白标，他憨憨地笑：“就觉得这个好喝！”

1.7 DPPH自由基清除能力测定

参照Hara等[21]的研究方法，并进行调整后测定6种蜂花粉破壁前后对DPPH的清除能力，分别吸取0.6 mL 不同浓度破壁前后的蜂花粉乙醇提取液，加入0.04 mg/mL的DPPH甲醇溶液5 mL，混匀后在暗处静置1 h，于517 nm处测其吸光度。结果以IC50值（抑制50% DPPH自由基时所需蜂花粉的浓度）表示，DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中A0为参比溶液的吸光值；A1为样品溶液吸光值。

1.8 Fe2+络合力测定

参照何亮亮等[22]方法，吸取200μL蜂花粉乙醇提取液，加入100μL浓度为1 mmol/L的FeSO4溶液，300μL 1 mmol/L的Ferrozine溶液，用甲醇定容至3 mL，混匀，10 min后于562 nm处测定吸光度。蜂花粉Fe2+络合力测定以mg/g表示（以Na2EDTA计）。

1.9 Fe3+还原力测定

参照Rao等[23]方法，取0.4 mL蜂花粉乙醇提取液，加入3.6 mL的TPTZ（10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液、300 mmol/L pH值为3.6醋酸缓冲液，1∶1∶10体积比配制)溶液，37 ℃反应10 min，于593 nm处测定吸光度。蜂花粉铁还原抗氧化力以mg/g表示（以Trolox计）。

1.10 对·OH诱导的pBR322质粒DNA氧化损伤保护作用的测定

使用琼脂糖凝胶电泳法分别测定蜂花粉破壁前后对·OH诱导的pBR322质粒DNA氧化损伤保护作用。参照陈思南等[24]方法进行测定。未破壁组：试验组加入1μL DNA、1μL 1.0 mmol/L FeSO4、1μL H2O2和3μL 0.3 mL/mL蜂花粉提取物，用50 mmol/L PBS磷酸盐缓冲液（pH值为7.0）定容到15μL，模型组用50 mmol/LPBS磷酸盐缓冲液代替样品，正常组添加1μLDNA和14μL磷酸盐缓冲液；破壁组：试验组加入1μL DNA、1μL 1.0 mmol/L FeSO4、1μL H2O2和3μL 0.3mL/mL破壁蜂花粉提取物，用50 mmol/L PBS磷酸盐缓冲液（pH值为7.0）定容到15μL，模型组用50 mmol/L PBS磷酸盐缓冲液代替样品，正常组添加1μLDNA和14μL磷酸盐缓冲液。于37 ℃下避光水浴30 min后，加入1μL上样缓冲液混合均匀，0.8%的琼脂糖凝胶中电泳50 min（电压为50 V）。使用凝胶成像仪（德国耶拿分析仪器股份公司）对电泳条带进行拍照，使用Quantity One软件进行数据分析，破壁前后的蜂花粉保护率用以下公式计算进行对比

1.11 数据处理

所有试验均测定3次，结果以平均值±标准偏差表示，使用SPSS 19.0软件进行方差分析和显著性分析，P＜0.05表示差异显著，采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶-高剪切联用对蜂花粉破壁率的影响

由于蜂花粉复杂的细胞壁，具有生物活性的化合物难以被充分释放，导致蜂花粉营养成分利用率低[25]，破壁可以使蜂花粉细胞壁破碎，内容物充分溶出，营养物质释放，提高蜂花粉营养物质利用率。本文首先研究了纤维素酶酶解对不同品种蜂花粉破壁率的影响，结果见图1和图2。不同种类的蜂花粉经破壁后，花粉孢子均呈现出不同程度的破裂现象，且随纤维素酶浓度的增加，蜂花粉的破壁率均增加。不同蜂花粉的细胞壁结构不同，因此对纤维素酶的耐受能力不同，本研究中玫瑰蜂花粉耐受力最强，纤维素酶添加量增加到8%时破壁率只有74%，荷花蜂花粉最弱，1%的纤维素酶就可使其破壁率达到87%。

基于以上研究结果，下述研究的破壁蜂花粉均采用破壁率达到90%以上的蜂花粉，具体破壁采用不同浓度的纤维素酶酶解与高剪切联用的方法（纤维素酶添加量：荷花1%；枣花4%；茶花2%；油菜1%；玫瑰4%；五味子3%），在此基础上探究破壁对蜂花粉酚类物质及抗氧化活性的影响。

2.2 纤维素酶-高剪切联用破壁对蜂花粉酚类化合物的影响

酚类化合物对癌症、动脉粥样硬化，免疫系统衰弱以及帕金森等疾病均有预防和治疗作用[27]，可用于防止氧化损伤，清除自由基，螯合金属离子的活性物质[28]。近年来，蜂花粉酚类化合物因其保健作用备受关注[29]。本文测定了6种蜂花粉破壁前后总黄酮、总酚含量见表1，6种蜂花粉破壁后总黄酮、总酚含量均有不同程度的增加。破壁后，油菜蜂花粉酚类物质的释放作用最为显著（P＜0.05），总酚含量由8.6 mg/g提高至21.6 mg/g，提高1.5倍，总黄酮含量提高6.4倍，阮征等[30]用纤维素酶-果胶酶-蛋白酶复合酶液酶解油菜蜂花粉，总黄酮含量由2.2447 mg/g提高到2.4312 mg/g，提高8.3%，相比而言本研究方法能够释放更多活性物质；经破壁后茶花蜂花粉总酚含量为15.7 mg/g，提高11.3%。油菜蜂花粉总黄酮含量最高，五味子蜂花粉破壁后总酚含量最高，荷花蜂花粉总黄酮、总酚含量较低。本文采用HPLC-DAD对6种蜂花粉中的酚类物质进行分析，结果见表2。茶花蜂花粉破壁后共检测出10种物质，较未破壁多检测出2种物质；肉桂酸和山奈酚在破壁后被释放，含量分别为0.72 mg/g和4.38 mg/g，没食子酸含量由0.39 mg/g增加到2.53 mg/g，柚皮素含量为6.50 mg/g，是破壁前4倍，且高于其他蜂花粉。油菜蜂花粉经破壁后，山奈酚和异甘草素溶出，异甘草素含量达到0.97 mg/g，系6种蜂花粉中含量最高，山奈酚含量达到2.32 mg/g，较Lv等[31]微波破壁检测得到的山奈酚含量少（23.44 mg/g），可能由于油菜蜂花粉破壁方式、产地影响，以及酚类富集方式不同，导致差异；油菜蜂花粉破壁后没食子酸含量为11.59 mg/g，较未破壁前提高59%，为所检测到的酚类物质中含量最高。枣花蜂花粉经破壁后检测出山奈酚，含量为10.31 mg/g，高于其他蜂花粉。破壁使玫瑰蜂花粉多检测出两种酚类物质，五味子蜂花粉多检测出三种酚类物质，荷花蜂花粉虽没有其他酚类物质溶出，但没食子酸含量有大幅度增加，由0.72 mg/g增加到4.43 mg/g，较破壁前提高5倍。破壁后，茶花蜂花粉检测出的酚类物质种类最多、含量最高，荷花蜂花粉酚类物质种类及含量均为最少。

表1 破壁前后蜂花粉的总黄酮、总酚含量 Table1 The content of total flavonoids and phenols in bee pollen before and after cell wall disruption

2.3 纤维素酶-高剪切联用破壁对蜂花粉体外抗氧化活性的影响

由表3可知，6种蜂花粉破壁后体外抗氧化能力均增强。DPPH自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）中氮原子的奇数电子通过从抗氧化剂接受一个氢原子到相应的肼而被还原[32]。酚类物质这类抗氧化剂可以有效减少DPPH自由基，对氧化应激损伤有保护作用[33]。测定IC50值越小，则自由基清除能力越强。经破壁后，同等质量下枣花蜂花粉清除50%DPPH自由基所需浓度降低约95%，油菜蜂花粉降低约92%，延莎等[34]采用气流超微粉碎破壁处理油菜蜂花粉后清除50%DPPH自由基所需蜂花粉浓度由0.338 mg/mL降低到0.315 mg/mL，仅降低6.8%，且破壁后检测到总黄酮含量由25.462 mg/g减少到23.611 mg/g，可见气流超微粉碎破壁方法效率不高且对蜂花粉营养物质有所损伤，相比而言酶解与高剪切联用的破壁方法使DPPH自由基清除能力更大，且溶出的总黄酮含量增加6.4倍，在不破坏其营养成分的同时释放更多的抗氧化物质。破壁对玫瑰蜂花粉和五味子蜂花粉DPPH自由基清除能力也有明显的增强趋势（P＜0.05）。Fe2+等过渡态离子能够催化Fenton反应产生·OH[35]，加速氧化反应，酚类化合物与Fe2+络合，中断氧化反应。破壁后6种蜂花粉Fe2+络合能力均有提高作用（P＜0.05），枣花蜂花粉Fe2+络合能力由0.36 mg/g提高至1.16 mg/g，提高约2.2倍；茶花、玫瑰蜂花粉提高约1倍，荷花、油菜、五味子蜂花粉较其他3种蜂花粉提升幅度较小。Fe3+还原力是指样品提供电子，将Fe3+还原为Fe2+，生成有色物质引起吸光度值增加[36]。破壁后6种蜂花粉的Fe3+还原力均提高（P＜0.05），其中对油菜蜂花粉影响作用最大，从6.20 mg/g提高至55.80 mg/g，提高8倍；其次为枣花蜂花粉，提高1.5倍；茶花蜂花粉破壁后Fe3+还原力由15.30 mg/g提高至24.20 mg/g。破壁对荷花蜂花粉和玫瑰蜂花粉Fe3+还原力影响较弱，但也有提高。

表3 破壁前后蜂花粉的抗氧化活性 Table 3 Antioxidant activity of bee pollen before and after cell wall disruption

基于以上数据，证实破壁能够增强蜂花粉体外抗氧化活性。破壁后，枣花蜂花粉DPPH自由基清除能力最强，主要基于其高含量的酚类化合物，五味子、油菜蜂花粉较其稍弱；茶花蜂花粉Fe2+络合力强于其余5种蜂花粉，可能源于茶花蜂花粉破壁后检测出的酚类物质种类和含量最多；五味子、油菜蜂花粉均有强Fe3+还原力，高含量的黄酮、酚酸能够将Fe3+还原为Fe2+。枣花、茶花、五味子、油菜蜂花粉含有丰富的酚类物质，表现出强抗氧化活性，可为蜂花粉抗氧化食品的开发利用提供理论依据。

2.4 纤维素酶-高剪切联用破壁蜂花粉对·OH诱导的pBR322质粒DNA氧化损伤保护作用的影响

H2O2是机体氧化代谢的副产物，是一种非自由基物质，很容易扩散到活细胞当中，过渡态金属离子条件下，Fenton反应中H2O2生成·OH，从而破坏DNA双螺旋结构。酚类化合物通过络合过渡态金属离子或者清除H2O2使得反应中断，从而保护DNA双螺旋结构[37]，通过计算DNA双螺旋结构占比来测定蜂花粉对·OH诱导的pBR322质粒DNA氧化损伤的保护作用。凝胶电泳成相后得到图4，6种蜂花粉破壁后，DNA双螺旋条带均更明亮清晰。由表4可知，破壁后，油菜蜂花粉对DNA氧化损伤的保护能力提高442.7%，茶花蜂花粉提高287.7%，荷花、枣花、玫瑰、五味子这4种蜂花粉分别提高了60.5%、12.4%、82.5%和4.8%，表明破壁使得蜂花粉中酚类物质得到充分的释放，可以有效提高对·OH诱导的pBR322质粒DNA氧化损伤的保护能力。

表4 破壁前后蜂花粉对DNA氧化损伤的保护率 Table 4 Protection rate of bee pollen against DNA oxidative damage before and after cell wall disruption %

3 结论

1）少量纤维素酶（荷花1%；枣花4%；茶花2%；油菜1%；玫瑰4%；五味子3%）结合高剪切技术使得6种蜂花粉达到90%以上破壁率。

2）6种蜂花粉经破壁作用后酚类物质种类及含量均增加，总黄酮、总酚含量显著增加（P＜0.05）。荷花蜂花粉没食子酸含量较破壁前提高5倍，油菜蜂花粉总黄酮含量提高6.4倍，总酚含量由8.6 mg/g提高至21.6 mg /g，茶花蜂花粉共检测到10种酚类物质，较未破壁前多2种。

3）体外抗氧化试验表明，破壁能够将枣花、油菜蜂花粉清除50%DPPH自由基所需浓度降低95%和92%，枣花蜂花粉Fe2+络合力提高2.2倍，油菜蜂花粉Fe3+还原力提高8倍。破壁后荷花、枣花、茶花、油菜、玫瑰、五味子6种蜂花粉对pBR322质粒DNA氧化损伤的保护作用分别提高了60.5%、12.4%、287.7%、442.7%、82.5%、4.8%。