生物胺降解乳酸菌的筛选与特性研究

王 强，周真江，曾维友，索化夷*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市江津区农业技术推广中心，重庆 402260）

生物胺是一类具有生物活性且含氮的低分子质量有机化合物[1]，主要由微生物的氨基酸脱羧酶对氨基酸（组氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）的脱羧作用而形成的有机化合物（组胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺）[2]。生物胺对人体具有重要意义，但是摄入过量的生物胺会使得血管扩张，导致人体产生痉挛、腹泻、心悸、呕吐、头痛、血压不稳、呼吸紊乱等不良反应，严重时可引起人体中毒[3]，而且部分生物胺过量会危害人体健康。所有生物胺中以组胺毒性最大，酪胺次之，本身毒性不高的尸胺能够增强前两者的毒性，其原因在于其可以抑制组胺/酪胺代谢酶[4]。因此，对食品中生物胺进行防控是极为必要的。

生物胺广泛存在于各类食品中，尤其是在发酵食品中占比更高[5]。目前对食品中的生物胺进行防控主要从两方面入手：一是控制食品在生产过程中生物胺的形成，如生产工艺控制[6]、食品添加剂控制[7]、超高压控制[8]、辐照控制[9]等；二是降解食品在生产过程中已经产生的生物胺，如开发添加具有生物胺氧化酶活性微生物的新型发酵剂等[10]。研究发现，存在许多具有生物胺氧化酶活性的微生物，如植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）等，同时也有研究发现，利用微生物对食品中生物胺进行防控的方法相比其他方法更加切实可行，并且稳定安全[11]。生物胺的生物降解技术已经在多种传统发酵食品中进行应用，如利用植物乳杆菌可以抑制香肠中生物胺的积累[12]，能显著降低泰国香肠中的生物胺含量[13]；通过添加植物乳杆菌降解葡萄酒发酵过程中生成的生物胺[14]。

传统发酵食品多为高盐高酸性食品，本研究拟通过对乳酸菌的生物胺产生活性、降解能力以及对高盐高酸性环境耐受能力的筛选，最终得到可以用于传统发酵食品中的生物胺降解菌株，为传统发酵食品安全性提升提供可靠的备选菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

实验中所用的41株乳酸菌为实验室前期分离纯化、鉴定并保藏的菌株，编号为1～41，保藏在西南大学食品科学学院。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in the study

1.1.2 培养基

营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；MRS肉汤（固体）培养基：广东环凯微生物科技有限公司；显色培养基[15]：NB培养基54 g，磷酸吡哆醛0.05 g，溴甲酚紫0.06 g，6种氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸）各5 g，去离子水1 000 mL，调pH值至5.2，于121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.1.3 化学试剂

磷酸吡哆醛（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；溴甲酚紫（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：重庆川东化工有限公司；尸胺、组胺、酪胺（纯度均≥98%）：美国Sigma公司；苯甲酰氯（纯度≥98%）：成都市科隆化学品有限公司；L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-精氨酸（纯度均≥98%）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司；LDZM-60KCS-II型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗机械厂；SW-CJ-2F型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；GHP-9160型恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；5810型高速低温离心机：德国Eppendorf公司；PGC-21D型氮吹仪：北京中诺远东公司；SYNERGYH1MG型全波长酶标仪：美国基因公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的活化、镜检

将保藏在安瓿管中的乳酸菌接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃、100 r/min条件下活化24 h，活化后划线于MRS固体培养基，37 ℃条件下培养24 h，观察平板上的菌落形态，并挑取单菌落于载玻片上均匀涂布，革兰氏染色后于显微镜下观察细胞形态，确定菌株为纯培养。

1.3.2 菌悬液的制备

试验所用菌株在MRS肉汤培养基中37 ℃条件下培养24 h后，取10 mL乳酸菌培养液于4 ℃、4 000 r/min条件下离心15 min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗涤两次，并将其OD600nm值调节为0.8，备用[16]。

1.3.3 生物胺合成活性筛选

以2%（V/V）的接种量将乳酸菌菌悬液接入到显色培养基中，37 ℃条件下培养48 h，记录培养基颜色（若为紫色，则菌株初步判定为阳性；若为黄色即不变色，则菌株初步判定为阴性），空白培养基（不接入菌悬液的培养基）作对照组，选取阴性菌株进行进一步研究。

1.3.4 生物胺降解菌株的筛选

以2%（V/V）的接种量将乳酸菌菌悬液接种于含三种生物胺（酪胺、腐胺、组胺）各500 μg/mL的MRS肉汤培养基中，37 ℃条件下培养48 h，以空白培养基（不接入菌悬液的培养基）为对照组，分别取1 mL菌液加入4 mL 0.1 mol/L HCl溶液中断菌株生长繁殖后，测定生物胺的含量，计算各菌株的生物胺降解率[17]，其计算公式如下：

式中：W0为对照组中生物胺的含量，μg/mL；W1为实验组中生物胺的含量，μg/mL。

1.3.5 生物胺含量的测定[18]

（1）标准曲线的绘制

分别准确称取尸胺、组胺、酪胺各50 mg，用0.1 mol/L HCl溶液定容至50 mL，制成质量浓度为1 000 μg/mL的生物胺混合标准溶液，备用。分别取上述生物胺混合标准溶液，用0.1 mol/L HCl溶液配制成质量浓度分别为1.0 μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的3种生物胺混合标准溶液。然后进行柱前衍生处理后上机检测，以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。

（2）柱前衍生

2 mL三种生物胺混合标准溶液中，加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液、10 μL苯甲酰氯标准溶液，然后旋涡振荡30 s，30 ℃水浴条件下避光反应40 min，期间每隔10 min振荡一次。反应结束后用2 mL饱和NaCl溶液中断反应。然后用3 mL乙醚萃取，1 200 r/min离心10 min，用移液枪移取乙醚层，重复萃取操作两次，35 ℃氮气吹干，最后用1 mL甲醇（色谱级）溶解，微滤（0.22 μm）后置于1 mL的液相小瓶中，于4 ℃下保存、待测。

（3）HPLC分析

对比浓缩前后卤水和透过液的组成，透过液的K，Na，Mg含量占原卤水含量的百分比分别为0.020 8%，0.016 70%，0.008 45%，说明膜蒸馏对卤水浓缩有显著的影响，卤水中的盐几乎截留在了膜的进料侧。测得卤水浓缩后的透过液的电导率是0.048～1.682 ms/cm，对比纯净水的电导率是 0～10 μs/cm，饮用水的电导率是 0～50 μs/cm，一般家用自来水的电导率为125～1 250 μs/cm，实验表明：膜蒸馏实验得到的透过液达到生活用水的标准。

根据钱茜茜等[19]的实验方法略作修改，色谱柱为Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为超纯水，流动相B为甲醇，紫外检测波长为254 nm，进样量为20 μL，流速为1.0 mL/min，采用梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program

1.3.6 生物胺降解菌株耐盐性能测定

以2%（V/V）的接种量将乳酸菌菌悬液接种于含不同NaCl（0、5%、7%、9%、11%）的MRS肉汤培养基中，37 ℃条件下培养24 h，测定波长600 nm处的吸光度值（OD600nm值），以不含NaCl且不接种菌的MRS肉汤培养基为空白对照，计算各菌株在不同NaCl含量条件下的生长效率[16]，其计算公式如下：

式中：A0为空白对照组的OD600nm值；A1为不含NaCl培养液的OD600nm值；A2为含不同浓度NaCl培养液的OD600nm值。

1.3.7 pH值对生物胺降解菌株生长的影响

以2%（V/V）的接种量将乳酸菌菌悬液分别接入到pH分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的MRS肉汤培养基中，37 ℃条件下培养24 h，测定波长600 nm处的吸光度值（OD600nm值），以不接种菌的MRS肉汤培养基为空白对照，以OD600nm值评价菌株的耐酸能力[20]。

1.3.8 数据处理及统计分析

所有实验均重复3次测定，结果以“平均值±标准偏差”（X±SD）表示，采用SPSS 20.0软件对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 有无生物胺合成活性乳酸菌的确认

在不利于自身生长繁殖的环境（即酸度略高、营养匮乏等环境）下，为了维持自身生长繁殖，具有氨基酸脱羧酶活性的乳酸菌受胁迫机制调控将氨基酸脱羧形成相应的生物胺（一种碱性物质）来改善环境，从而有利于自身生长繁殖[21]。溴甲酚紫在酸性条件下显示黄色，可初步判断菌株不具有氨基酸脱羧酶活性即为不产生物胺的阴性菌株，在碱性条件下显示紫色，可初步判断菌株具有氨基酸脱羧酶活性即为产生物胺的阳性菌株[22]。根据液体培养基的显色情况从41株乳酸菌株中初步筛选出了9株阴性菌株，分别为菌株2、4、10、21、27、28、29、30、40，其余32株菌株均为阳性菌株。

2.2 生物胺标准液的高效液相色谱图及标准曲线

3种生物胺（组胺、酪胺、尸胺）标准品的HPLC色谱图见图1，标准曲线见表3。

图1 3种生物胺标准品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 3 biogenic amines standard

由图1可知，3种生物胺（组胺、酪胺、尸胺）在高效液相色谱上出峰速度快，分离明显，20 min内全部出峰，分别为尸胺在7.1 min左右出峰，组胺在16.7 min左右出峰，酪胺在18.9 min作左右出峰，故此方法对分离检测生物胺具有良好的效果。

表3 3种生物胺的线性回归方程及相关系数Table 3 Linear regression equation and correlation coefficient of 3 biogenic amines

由表3可知，3种生物胺（组胺、酪胺、尸胺）的峰面积与其对应质量浓度分别呈现良好正相关的线性关系，相关系数R2均＞0.992 0，说明该方法能够可靠的定量分析这3种生物胺。

2.3 生物胺降解菌株的筛选

在显色实验初步筛选的基础上，采用HPLC法定量检测生物胺，从而保证了实验结果的准确性和严谨性，对菌株降解生物胺的能力做出准确的评价。根据9株阴性菌株的生物胺含量测定结果，计算出3种生物胺的降解率，结果见表4。

表4 9株乳酸菌菌株对生物胺的降解作用Table 4 Degradation of biogenic amines by 9 strains of lactic acid bacteria

由表4可知，9株阴性菌株降解生物胺的能力各不相同，且差异较大，其中菌株40（嗜酸乳杆菌）对组胺和酪胺无降解能力，有组胺和酪胺合成能力，说明菌株40产酸能力强于生物胺生成能力。菌株27（戊糖乳杆菌）对尸胺的降解能力最强，达到了63.11%；菌株2（发酵乳杆菌）对组胺的降解能力最强，达到了82.95%；菌株30（植物乳杆菌）对酪胺的降解能力最强，达到了89.97%。菌株2、4、27、28、30对3种生物胺的降解能力均＞50%，其中，菌株30（植物乳杆菌）对3种生物胺均有较好的降解能力，分别为62.42%（尸胺）、74.32%（组胺）、89.97%（酪胺），是一株较理想的高效生物胺降解菌株。生物胺测定实验结果表明，同一种属不同菌株的乳酸菌，其生物胺降解能力不同，因此，其生物胺降解能力仅具有菌株特异性，而不具有种属特异性[23]。故选取菌株2、4、27、28、30进行后续实验。

2.4 生物胺降解菌株的耐盐性能筛选

我国大部分发酵食品具有高盐高渗透压的环境，因此若想将生物胺降解菌株运用于发酵食品中就需要菌株能够适应高盐高渗透压的环境[24]。对5株生物胺降解效果较好的菌株进行耐盐试验，测定其在不同盐含量下的生长效率，结果见图2。由图2可知，对于5株菌，其环境中的NaCl含量与生长情况呈现明显的负相关关系。当NaCl含量为7%时，菌株4和27几乎不生长；当NaCl含量为9%时，菌株2几乎不生长；当NaCl含量为11%时，菌株28、30仍有一定的耐盐能力，生长效率分别为4.50%和4.31%。故选取菌株28、30进行后续实验。

图2 5株菌株在不同盐含量下的生长效率Fig.2 Growth efficiency of 5 strains under different salt concentrations

2.5 pH值对生物胺降解菌株生长的影响

合适的pH值是乳酸菌正常生长代谢以及降解生物胺的必备条件[25]，因为只有在一定的pH环境下生物胺氧化酶才能够有效的发挥作用，因此若想将生物胺降解菌株运用于发酵食品中生长良好就需要探究菌株适宜的pH环境。考察pH值对2株优良乳酸菌（菌株28、30）生长的影响，结果见图3。由图3可知，菌株28的最佳生长pH值为5.5～7.5，菌株30的最佳生长pH值为5.5～8.5；当pH值为4.5时，两株菌仍具有良好的生长能力，菌株30的生长能力强于菌株28。因此，菌株30的耐酸性最好。

图3 筛选菌株不同pH值下的生长情况Fig.3 Growth situation of selected strains in different pH conditions

3 结论

从41株乳酸菌中筛选得到5株高效降解生物胺的菌株，其中以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）30的生物胺降解能力最好，其对3种生物胺的降解率分别为74.32%（组胺）、89.97%（酪胺）、62.42%（尸胺），在含盐量0～9%和pH值为4.5～8.5环境中能够较好的生长繁殖。该菌株无生物胺生成活性，并同时具备生物胺降解能力和耐盐耐酸能力，可以作为传统发酵食品生物胺降解备选菌株，用于提高传统发酵食品安全性。