HPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中烟碱、可替宁对映体及其药代动力学研究

金光祥，韩书磊，陈 欢，付亚宁，王红娟，刘 彤，陈 建，史智浩，侯宏卫，胡清源

(国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001)

烟碱是烟草及烟草制品具有潜在致瘾性的决定性因素和主要药理活性物质，可替宁是评估烟碱暴露量的主要代谢物[1]。烟碱及可替宁都有2个对映异构体：S-烟碱((-)-烟碱)、R-烟碱((+)-烟碱)和S-可替宁((-)-可替宁)、R-可替宁((+)-可替宁)，其结构示于图1。传统以烟草为原料的烟草制品含有的烟碱主要是S-烟碱，R-烟碱仅占总烟碱含量的0.1%～1.2%，而卷烟烟气中的R-烟碱比例最高可达3%[2-4]。2015年以来，以电子烟为代表的新型烟草制品快速发展，基于成本等因素考虑，电子烟烟液中的烟碱主要来源于烟草提取。近年来，合成烟碱((R,S)-烟碱)开始在电子烟中应用[2,5-6]，其与提取烟碱最大的不同之处在于使用了与S-烟碱互为对映异构体的R-烟碱[6]。虽然对映异构体的分子式相同，但结构不同，所以会导致其生化、生理性质的差异，如药理、毒理、生物代谢、生物富集性质等[7-8]差异。因此，由于对映异构体化合物的活性差异，包括美国食品药品管理局(FDA)在内的世界多国都要求对对映异构体药物的药理学及毒性等进行研究[9]。但是，相对于S-烟碱，人们对R-烟碱的研究很少，R-烟碱和S-烟碱的生化及生理性质，如毒性、与烟碱乙酰胆碱受体(AChR)的作用等[10-16]可能存在不同。生物样本中对映异构体的手性分析是研究目标物药理学及毒性等生理作用的关键[17]。但是，烟碱及其主要代谢物可替宁在生物体内的手性分析及药代动力学差异尚未见文献报道。

图1 烟碱及可替宁对映异构体结构式Fig.1 Chemical structures of nicotine and cotinine enantiomers

目前，烟碱、可替宁对映异构体的手性分析方法主要包括正相液相色谱法[2]、多维气相色谱-质谱联用法[3]、毛细管电泳法[18]等。其中，正相液相色谱法的灵敏度与准确性较低，且不与质谱兼容；多维气相色谱-质谱联用法的用时较长且分离效果不理想；毛细管电泳法的灵敏度与准确性较低，且这些方法所分析的样品都为烟草及烟草制品，没有涉及生物样品。近年来，反相高效液相色谱法或高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)开始应用于烟碱对映异构体分离[5,19]，但是，这些研究没有同时实现烟碱及其主要代谢物可替宁的手性分离，且没有研究烟碱对映异构体在生物体内的药代动力学差异。因此，本研究拟建立HPLC-MS/MS法同时分析大鼠血浆中烟碱及可替宁对映异构体，按照FDA对生物样本分析方法验证的要求进行方法验证[20]，并应用该方法开展烟碱对映异构体在大鼠血浆中的药代动力学研究。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

实验所用的HPLC-MS/MS系统由Agilent 1200高效液相色谱仪(包括G1367D自动进样器、G1312B二元溶剂泵、G1316B 柱温箱)及AB Sciex 5500三重四极杆串联质谱仪(配ESI离子源)组成，数据采集与处理软件为Analyst 1.5.1 Software；MSS-100型小动物麻醉机：英国Mss公司产品；3-18KS型台式高速冷冻离心机：德国Sigma公司产品；Vortex Genie 2涡旋振荡器：美国Scientific Industries公司产品；电子天平(感量0.000 1 g)：德国Sartorius公司产品；代谢动力学参数：由DAS药代动力学程序(Drug And Statistics for Windows，Ver3.0，中国药理学会数学药理专业委员会)处理得到。

1.2 主要材料与试剂

雄性SD大鼠(SPF级，体质量为220～250 g)：由郑州大学实验动物中心提供。大鼠饲养于独立通气笼具内，自由取食，昼夜交替均为12 h，饲养环境温度(23±2) ℃，相对湿度40%～60%。

S-烟碱(S-Nic)、R-烟碱(R-Nic)、S-可替宁(S-Cot)、R-可替宁(R-Cot)及其内标(R,S)-烟碱-d3((R,S)-Nic-d3)、(R,S)-可替宁-d3((R,S)-Cot-d3)：均为加拿大Toronto Research Chemicals公司产品；甲醇(色谱纯)：美国J&T Baker公司产品；乙腈(色谱纯)：德国Chemicell公司产品；甲酸铵(色谱纯)：美国Sigma公司产品；醋酸铵(色谱纯)：美国Tedia公司产品；肝素钠：美国Amresco公司产品；生理盐水：河南科伦药业有限公司产品；异氟烷：友诚生物公司产品；实验用水：由美国Millipore公司的Milli-Q超纯水系统制得。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 采用Chiralpak IG-3手性柱(250 mm×4.6 mm×3 μm)进行目标物分离，并加保护柱(10 mm×4.0 mm×3 μm)；柱温30 ℃；流动相为0.2%甲酸铵-甲醇溶液；流速1.2 mL/min；进样体积10 μL；运行时长15 min。切换阀设置：为保护离子源，0～5 min带有高浓度盐分及其他杂质的流动相以废液流出；5 min后阀切换开始进入质谱分析。

1.3.2质谱条件 多反应监测模式(MRM)，电喷雾离子源(ESI)，正离子模式扫描。ESI源参数：电喷雾电压(IS)5 000 V，气帘气(CUR)压力2.4×105Pa，雾化气(GS1)压力4.8×105Pa，辅助加热气(GS2)压力4.8×105Pa，温度600 ℃，碰撞气(CAD)压力4.1×104Pa。通过优化参数，烟碱及其代谢物的标准品、内标的质谱参数列于表1。

表1 目标物和内标的MRM参数Table 1 Parameters of MRM mode for target analytes and internal standards

1.4 标准工作溶液的配制

标准储备液的配制：用甲醇溶解标准品并定容，制备约1.0 g/L的一级标准储备液，再将一级标准储备液用甲醇稀释1 000倍，得到约1 000 μg/L的二级标准储备液。

内标储备液的配制：用甲醇溶解氘代内标并定容，制备约1.0 g/L的一级内标储备液，再将一级内标储备液用甲醇稀释1 000倍，得到约1 000 μg/L的二级内标储备液。

内标萃取溶液的配制：将二级内标储备液用甲醇逐级稀释为约25 μg/L的内标萃取溶液。

标准工作溶液的配制：采用甲醇配制系列标准工作溶液，得到目标物浓度分别为0.50、1.00、2.50、5.00、20.0、50.0、100、250 μg/L的工作溶液，内标浓度均为20 μg/L，其中，(R,S)-Nic-d3中的S-Nic-d3作为S-Nic、R-Nic的内标，(R,S)-Cot-d3中的R-Cot-d3作为S-Cot、R-Cot的内标。

1.5 血浆样品的制备

取5只雄性SD大鼠，给药前禁食12 h，自由饮水。以1.0 mg/kg的剂量皮下注射给药(烟碱溶于生理盐水中，浓度为1.0 μg/L)，使用麻醉机以异氟烷麻醉后，于给药前及给药后3、8、15、20、30、45、60、120、180、300、480、660、1 440 min从大鼠眼眶后静脉丛取血0.2～0.4 mL，置于含有5 μL肝素钠溶液(10 g/L)的1.5 mL EP离心管中，充分摇匀，以4 000 r/min离心10 min后，分离血浆，于-40 ℃保存，待分析测定。

1.6 血浆样品前处理

待测血浆样品(-40 ℃)于室温下自然解冻后，精密吸取50 μL，加入200 μL 4 ℃冷藏的内标萃取溶液以沉淀蛋白，涡旋振荡1 min后，于4 ℃以15 000 r/min离心10 min，取约150 μL上清液，置于装有玻璃内插管的2 mL棕色色谱瓶中，待HPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离条件的优化与确定

根据文献[19]报道，AZYP公司的Nico-Shell(100 mm×4.6 mm×2.7 μm)和Teico-Shell(150 mm×4.6 mm×2.7 μm)分别在分离烟碱、可替宁对映异构体时的效果较好。研究发现：1) 流动相为甲醇-甲酸铵溶液，等度洗脱，流速1 mL/min时[19]，NicoShell能够实现烟碱对映异构体的基线分离(分离度R=2.22，示于图2a)，但是对可替宁对映异构体的分离效果较差(分离度R=0.88，示于图2b)。进一步优化流动相，如使用水相和有机相配合的梯度洗脱，调节柱温箱温度和流动相流速等条件，对目标物的分离效果改善不明显。2) 流动相为100%甲醇，等度洗脱，流速0.2 mL/min时[19]，烟碱对映异构体在TeicoShell色谱柱上无保留，示于图2c，而对可替宁对映异构体的分离效果不理想(分离度R=0.56，示于图2d)，通过优化色谱条件并没有明显改善分离效果。3) 采用大赛璐公司的Chiralpak IG-3手性色谱柱(250 mm×4.6 mm×3 μm)(以下简称“IG-3柱”)取得了较理想的效果，烟碱对映异构体基本能够实现完全分离(分离度R=1.40，示于图2e)，可替宁对映异构体也能够实现完全分离(分离度R>10，示于图2f)。优化后的色谱分离条件：流动相为0.2%甲酸铵-甲醇，流速1.2 mL/min，等度洗脱，柱温30 ℃。

2.2 样品前处理条件的确定

目前，LC-MS/MS测定人体和动物组织及体液中烟碱及其代谢物的样品前处理方法主要有蛋白沉淀法[21-24]、液-液萃取法[25-26]、固相萃取法[27-28]等。其中，液-液萃取法对目标物的回收率偏低；而固相萃取法较为耗时、耗力，不适用于大批量样品分析。因此，本研究采用蛋白沉淀法对大鼠血浆样品进行前处理，其优点是省时、省力，适合大批量的样品分析。分别采用乙腈、甲醇作为沉淀剂，发现二者沉淀蛋白的效果差别不大，目标物不存在基质干扰现象，但考虑到液相色谱流动相所使用缓冲溶液的溶剂是甲醇，为保证进样兼容性和一致性，最终选择甲醇蛋白沉淀法进行血浆样品处理。

2.3 选择性

取6只大鼠的空白血浆，按1.6节方法处理，在1.3节条件下分别检测空白血浆及1 mg/kg剂量下，大鼠给药(R,S)-烟碱20 min后血浆内的(R,S)-烟碱、(R,S)-可替宁及其内标((R,S)-烟碱-d3、(R,S)-可替宁-d3)，以验证方法的选择性。结果发现，血浆中生物基质对(R,S)-烟碱、(R,S)-可替宁及其内标无干扰，表明该方法具有较好的选择性，结果示于图3。

注：a.b.NicoShell柱；c.d.TeicoShell柱；e.f.IG-3柱；1.S-烟碱；2.R-烟碱；3.S-可替宁；4.R-可替宁图2 不同手性柱分离烟碱、可替宁对映异构体的色谱图Fig.2 Chromatograms of enantiomers of nicotine and cotinine separated by three chiral columns

注：a.(R,S)-烟碱；b.(R,S)-可替宁；c.(R,S)-烟碱-d3；d.(R,S)-可替宁-d3图3 典型大鼠血浆样本中烟碱、可替宁对映异构体及其内标的色谱图Fig.3 Chromatograms of enantiomers of nicotine and cotinine and their internal standards in rat plasma

2.4 标准工作曲线及定量限

对标准工作溶液及样品溶液进行HPLC-MS/MS分析，以各目标物的色谱峰面积与内标峰面积之比(y)对其浓度(x，μg/L)进行线性回归，得到的线性回归方程及相关系数列于表2。可知，各目标物在0.5～250 μg/L范围内的线性关系良好(R2≥0.995)，定量限均为0.5 μg/L，适合样品中痕量目标物的分析。

2.5 精密度和准确度

按照1.6节方法配制2.50、10.00、40.00 μg/L三种不同浓度的血浆样本各5份，进行日内及日间精密度及准确度实验，结果列于表3。结果表明，目标物的日内及日间精密度均不高于12.0%，日内及日间准确度在91.3%～110.4%之间，均能满足方法学验证要求。

表2 各目标物的线性回归方程、相关系数和定量限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and LOQs of target analytes

表3 方法日内、日间精密度和准确度Table 3 Intra-day and inter-day accuracy, precision of the method

2.6 基质效应

取空白溶液及分别来源于5只大鼠的空白血浆，配制2.50、10.00、40.00 μg/L的烟碱及可替宁对映异构体的无基质和基质样本，通过比较基质样本和无基质样本中目标化合物峰面积比值来考察基质效应。结果发现，S-烟碱基质效应分别为74.5%、78.2%、81.6%，R-烟碱基质效应分别为73.7%、77.5%、80.9%，S-可替宁基质效应分别为96.5%、97.3%、98.5%，R-可替宁基质效应分别为95.8%、97.6%、101.9%。由此可见，烟碱对映异构体皆出现较弱的基质减弱效应，而可替宁对映异构体的基质效应不明显。

2.7 稳定性

对2.50、10.00、40.00 μg/L的烟碱及可替宁对映异构体血浆样本进行稳定性考察(n=5)，包括短期稳定性(室温放置6 h)、长期稳定性(-20 ℃冷藏30天)和冷冻-解冻稳定性(-20 ℃和室温循环3次)。结果表明，烟碱、可替宁对映异构体在以上各种稳定性研究实验条件下均能保持稳定。

2.8 药代动力学研究

采用HPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中烟碱、可替宁对映异构体，研究(R,S)-烟碱在皮下注射、1.0 mg/kg剂量下大鼠体内的药代动力学。烟碱、可替宁对映异构体的平均血药浓度-时间曲线示于图4，药代动力学参数列于表4。

图4 烟碱(a)、可替宁(b)对映异构体的平均血药浓度-时间曲线(n=5)Fig.4 Average plasma concentration-time curves of enantiomers of nicotine (a) and cotinine (b) (n=5)

表4 烟碱、可替宁对映异构体的药代动力学参数均值(n=5)Table 4 Average pharmacokinetic parameters of enantiomers of nicotine and cotinine (n=5)

由图4和表4可知：1) 烟碱、可替宁对映异构体的血药浓度-时间曲线可显著分为吸收(生成)和消除2个阶段，S-烟碱和R-烟碱在皮下注射后可在大鼠体内迅速吸收，达峰时间分别为0.39和0.33 h，半衰期分别为0.97和0.82 h，达峰浓度分别为213.20和206.20 μg/L，二者不存在显著性差异，表明S-烟碱和R-烟碱在大鼠血液中具有类似的代谢行为。2)S-可替宁和R-可替宁同时在2.33 h左右达到最高浓度，其半衰期分别为9.79、5.95 h，达峰浓度分别为176.13、160.33 μg/L。这表明S-烟碱和R-烟碱在大鼠血液中分别代谢为S-可替宁和R-可替宁的速率无显著性差异，但S-可替宁比R-可替宁的清除速度慢，并存在显著性差异(p<0.05)。

3 结论

本研究建立了HPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆样本中烟碱、可替宁对映异构体，并开展药代动力学研究。在优化的实验条件下，烟碱、可替宁对映异构体能同时实现基线分离，目标物的线性范围为0.5～250 μg/L，定量限为0.5 μg/L。方法学验证结果表明，该方法的选择性、准确性、精密度、基质效应、稳定性等均能满足要求。大鼠血浆药代动力学研究结果表明，烟碱对映异构体的代谢行为无显著性差异，S-可替宁和R-可替宁的生成速率无显著性差异，但S-可替宁的清除速度显著慢于R-可替宁。