不同染料标识木栓细胞壁中木栓脂的分布

张 宝，陈冰炜，翟胜丞,2*，潘 彪，魏建强，勇 强

(1.南京林业大学 材料科学与工程学院，江苏 南京 210037；2.南京林业大学 林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037；3.南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037)

木栓细胞(phellem cell)，即软木细胞(cork)[1]，其细胞壁主要成分为木栓脂(suberin)、木质素(lignin)、多糖(polysaccharide)等高分子聚合物[2-3]；如栓皮栎软木中木栓脂的质量分数约40%[4-5]。木栓脂化学性质比较稳定，具有较好的耐腐性和耐老化性。目前软木的主要应用是通过与其他材料复合以制备板材，可赋予板材一定吸振、吸声的功能，可满足公共场所和家庭场所的减噪需求[6]；木栓脂可通过己酸胆碱催化解聚以最大程度的保留木栓脂的分子完整性、进而加工制成具有一定程度的抗菌性、防水性的薄膜，具有良好的应用前景[11]。

木栓脂化学结构与木质素有较大不同，因此可通过不同染料对于化学组分的特异性染色来进行区分。染色对观察生物材料的组织结构、化学组分分布等至关重要，将生物材料进行染色，可以对细胞或细胞壁中的某特定化学物质进行染色，以观察该化学物质在细胞或细胞壁中的分布。如K.Kobayashi等[7]使用甲苯胺蓝对日本晚樱栓质化细胞进行染色，观察到木质素主要存在于栓质化细胞的细胞壁内侧部分。

根据前人研究，植物细胞染色常用染料有甲苯胺蓝[7]、硫酸氢黄连素[8]、番红O、固绿[9]、苏丹类染料[10]、间苯三酚显色反应[11-12]等，适用于木质化或者栓质化细胞的染色[13]，但是如何区分细胞壁层中木质化和栓质化部分，仍有待摸索。日本晚樱树皮中的木栓细胞具有较好的柔韧性，且细胞在弦向可伸长至原始尺寸的2到3倍[7]。本研究采用了苏丹Ⅲ染色法、苏丹红7B染色法、甲苯胺蓝染色法、硫酸氢黄连素-苯胺蓝对染法和盐酸-间苯三酚染色法五种染色方法对日本晚樱树皮切片进行染色，采用光学显微镜(含荧光显微镜)进行观察，确定木栓细胞在树木周皮中的分布及木栓脂在木栓细胞不同壁层的分布。通过比较不同染色方法，开展日本晚樱(Cerasusserrulata)树皮中栓质化细胞壁主要化学成分分布的研究，有助于后期进一步深入了解木栓细胞在植物生长过程中的形成及木栓脂堆积的过程，掌握周皮对植物保护作用的机理。

1 材料与方法

1.1 材料

试验对象：日本晚樱树皮取自南京林业大学校园，从树干上取得尺寸为10 mm×10 mm×5 mm(L×T×R)的树皮。

染料：苏丹Ⅲ(Sudan Ⅲ，国药集团化学有限公司)，苏丹红7B(Sudan Red 7B，国药集团化学有限公司)，甲苯胺蓝O(Toluidine Blue O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，苯胺蓝(Aniline Blue，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，硫酸氢黄连素(Berberine Bisulfate，上海麦克林生化科技有限公司)，间苯三酚(Phloroglucinol，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

包埋剂：LR-white树脂(London Resin Company Ltd)，环氧树脂Epon812(Epon812、NMA、DDSA、DMP-30产自Structure Probe公司)。

其他：FAA固定液(磷酸二氢钠4.0 g，磷酸氢二钠6.5 g，37%甲醛100.0 mL，蒸馏水900.0 mL，浙江金华同和生物技术有限公司)，盐酸(Hydrochloride，南京化学试剂股份有限公司)，聚乙二醇200(上海灵峰化学试剂有限公司)，丙三醇(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品包埋 环氧树脂Epon812包埋：样品饱水、戊二醛固定、PBS缓冲液调节pH、酒精梯度脱水、丙酮梯度脱酒精、配置树脂、样品包埋、树脂聚合(37℃，过夜；45℃，12 h；60℃，24 h)。

LR-white树脂包埋：样品饱水、配置树脂(向500 g树脂中加入9.9 g催化剂，避光混合均匀)、样品包埋(将饱水后的样品放入树脂中)、树脂聚合(在65℃烘箱中进行树脂聚合)。

1.2.2 切片制备 待日本晚樱树皮在FAA组织固定液中浸泡24 h后，将树皮修成1 mm×1 mm×3 mm的小样，分别采用LR-white树脂和Epon812环氧树脂进行包埋。包埋样品经单面刀修样后，使用半薄切片机(LEICA，RM2265)进行切片，切片厚度为3 μm。

1.2.3 染液配制及切片染色 本实验所用染料分别为甲苯胺蓝染液、苏丹红7B染液、硫酸氢黄连素染液、苯胺蓝染液、苏丹Ⅲ染液和间苯三酚染液，染液详细配制方法如表1所示。染液配制好后，按照表2中的染色步骤进行染色。染色后的切片，经漂洗浮色后，进行封片。封片剂为甘油水溶液。

1.2.4 切片观察 使用型号OLYMPUS，BX51荧光显微镜进行观察。蓝色激发光波长450～480 nm，拍照设备OPLENIC DIGITAL CAMEREA。

2 结果与分析

2.1 普通染料染色

分别采用甲苯胺蓝、盐酸-间苯三酚、苏丹Ⅲ和苏丹红7B对日本晚樱树皮经环氧树脂Epon812包埋后的切片进行染色，并采用光学显微镜进行观察，显微图像如图1所示。图1a为未染色显微图像，图中木栓细胞形态不规整，细胞间无细胞间隙，且相邻细胞间的连接方式为搭接。图1b为盐酸-间苯三酚染色结果，间苯三酚在酸性条件下主要使木质化的细胞壁着色[14]，但在图中并未观察到木质素被染上颜色，这可能与包埋时所用树脂相关。图1c为苏丹Ⅲ染色结果，可观察到木栓细胞壁在染色后分为两个部分，木栓细胞壁远离细胞腔部分(即细胞壁外侧)被染上红色，靠近细胞腔的细胞壁(即细胞壁内侧)仍为无色。苏丹Ⅲ为脂溶性染料，易溶于脂类物质可使脂类物质着色[7]，图1d为苏丹红7B染色结果，可以看到木栓细胞壁的内侧部分为无色，木栓细胞壁的外侧部分为紫红色，其染色结果与苏丹Ⅲ类似，可使木栓细胞细胞壁的木栓脂着色。

注：箭头：木质素，箭：木栓脂，标尺=20 μm。

表1 不同染料的配制方法Table 1 Preparation of different dyes

表2 5种染色方法染色步骤Table 2 Dyeing steps

2.2 荧光染料

2.2.1 甲苯胺蓝染色 甲苯胺蓝作为染料既可以在明场下观察，也可以在荧光下观察。使用荧光显微镜观察未染色、甲苯胺蓝染色及硫酸氢黄连素染色效果，如图2所示。图2a为未染色切片在明场下的显微图片，可以看到径切面上木栓细胞形态不规整。图2b为未染色切片在蓝色激发光下的显微图片，图中木栓细胞荧光强度与颜色相差不大，较难区分木栓细胞壁的成分分布。图2c为甲苯胺蓝染色明场下显微图片木栓细胞壁的内侧染上蓝色，木栓细胞壁的外侧着色较浅至无色。图2d为甲苯胺蓝染色切片在荧光显微镜下的图片，与未染色切片在紫色激发光下观察比较，发现木质素的荧光消失，木栓脂的荧光变暗。甲苯胺蓝主要使细胞壁中木质素及多糖类物质着色[7]。苏丹Ⅲ与苏丹红7B均为脂溶性染料，而木栓细胞中含有的脂类物质主要为木栓脂，因此苏丹Ⅲ染色后显红色的细胞壁为木栓脂。甲苯胺蓝、苏丹Ⅲ和苏丹红7B染色结果均表明木栓细胞壁的内侧部分主要成分为木质素和多糖，外侧部分主要成分为木栓脂。甲苯胺蓝染色后木质素与木栓脂的荧光均变暗，说明在蓝色激发光下甲苯胺蓝可以抑制木质素和木栓脂的自发荧光[15]，表明甲苯胺蓝主要使木质素着色，也可使木栓脂着色但着色程度较浅。

注:a为未染色，b为未染色切片在蓝色激发光下的显微图片，c为甲苯胺蓝染色，d为甲苯胺蓝染色切片在蓝色激发光下的显微图片，箭头：木质素，箭：木栓脂，标尺=20 μm。

2.2.2 硫酸氢黄连素-苯胺蓝对染法 硫酸氢黄连素-苯胺蓝对染法染色结果如图3所示，硫酸氢黄连素-苯胺蓝为荧光染色，在明场下(图3a)较难分辨木栓脂和木质素不同。蓝色激发光下硫酸氢黄连素的染色结果(图3b)发现，木栓细胞壁的内侧呈现为黄绿色，细胞壁的外侧呈现为灰绿色。硫酸氢黄连素-苯胺蓝染色后就染色效果与图1b中未染色相比，染色后木质素与木栓脂的荧光得到不同程度的增强，从而观察到木质素和木栓脂的分布。根据前人研究[16]硫酸氢黄连素-苯胺蓝对染法中，硫酸氢黄连素主要使木栓脂的荧光增强；苯胺蓝可作为木质素自发荧光的抑制剂[17]，在激发光下可观察到木质素的自发荧光变暗。结合以上分析可知，硫酸氢黄连素-苯胺蓝对染色法，可在增强木栓脂的荧光同时，抑制木质素的自发荧光，从而在荧光显微镜下区分并确定木栓细胞壁木栓脂和木质素的分布。

注:a为染色后明场下显微图片，b为染色后蓝色激发光下的显微图片，箭头：木质素，箭：木栓脂，标尺=20 μm。

2.3 盐酸-间苯三酚染色切片改良

图1b为使用环氧树脂包埋后制作切片染色结果，其染色效果较差。为探究不同包埋树脂对染色效果的影响，根据间苯三酚的化学性质，选用亲水性树脂LR-white树脂对日本晚樱树皮进行包埋，切片后再次染色。发现图4中木栓细胞细胞壁内侧被染上了红棕色，间苯三酚在酸性条件下主要使木质素着色，由此可知木栓细胞壁的内侧主要成分为木质素，这与前面的染色结果相互验证，也表明使用亲水性染料染色时，LR-white树脂包埋后切片的染色效果优于环氧树脂包埋染色效果。盐酸-间苯三酚染色法对环氧树脂和LR-white两种树脂包埋后的切片进行染色后，环氧树脂包埋后的切片仍为无色，而LR-white树脂包埋后切片木栓细胞壁的内侧被染上樱红色，表明树脂对盐酸-间苯三酚染色有影响，主要原因为LR-white树脂为亲水性树脂，且间苯三酚具有羟基，因此，间苯三酚更容易作用于切片使木质素着色。

注:箭头：木质素，箭：木栓脂，标尺=20 μm。

3 结论

染色后在明场下观察，苏丹Ⅲ的染色效果最好，可以直接将木栓脂染成红色。同时结合甲苯胺蓝、苏丹红7B和盐酸-间苯三酚染色确定木栓脂主要存在于木栓细胞壁的最外层。

甲苯胺蓝可以抑制木质素的自发荧光，避免木质素的自发荧光的干扰，直接观察到木栓脂的荧光。

硫酸氢黄连素-苯胺蓝染色后，木栓脂的荧光在木栓细胞壁外侧呈灰绿色，木质素的荧光在木栓细胞壁的内侧呈黄绿色。

盐酸-间苯三酚染色后，木栓细胞壁内侧的木质素呈现为红棕色，且环氧树脂包埋会降低盐酸-间苯三酚的染色效果。