血小板活化对肠微血管内皮细胞血管生成影响的实验研究

翟金海 张佳怡 徐速

1江苏医药职业学院医学院（江苏盐城224008）；2南京中医药大学第一临床医学院（南京210001）；3南京中医药大学附属盐城市中医院（江苏盐城224001）

克罗恩病（crohn disease，CD）是一种慢性非特异性肉芽肿性炎症［1］，其发病机制尚不清楚，通常被认为与免疫因素有关，是消化科常见难治性疾病之一。由于肠壁的慢性炎症反复刺激，形成了整个肠纤维化层，导致肠道狭窄甚至梗阻。CD导致的肠腔狭窄等严重并发症［2］，常需手术治疗。CD 活动期患者外周血小板的异常增高与活化，常与活动程度相关性较高，可作为疾病活动度的一个评估指标［3］。近几年国内外对肠纤维化的发病机制有较多研究进展，其中血管生成被认为是其中十分关键的环节［4］，但目前还没有从干预血管生成的角度来改善肠纤维化的研究。本实验通过观察比较加入PI3K/mTOR 抑制剂BEZ235 前后，IMECs 细胞迁移、管腔形成能力的变化来研究活化的血小板对IMECs 血管生成的影响。观察对PI3K/AKT/mTOR 信号通路磷酸化相关蛋白及HIF⁃1α的蛋白表达的影响，以及对纤维化相关因子E⁃cadherin、α⁃SMA、CollagenI 蛋白表达变化和基因表达水平的影响，探讨血小板活化诱导的IMECs 细胞的EMT 的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞大鼠IMECs 细胞。

1.1.2 主要试剂DMEM/F12 细胞培养液和胰蛋白酶EDTA（美国GIBCO 公司），胎牛血清（Biologi⁃cal Industries，批号：1418110），Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司Cat.No.2010242），Streptomycin Sulfate（AMRESCO 公司Cat.No.2010382），NaHCO3（美国Gibco 公司Cat.No.11810⁃033），Trypsin（AM⁃RESCO公司Cat.No.2010/04），Trizol（美国Invitrogen公司Cat No.15596⁃026），SDS：santacruze公司（Cat No.sc⁃264510），PVDF 转移膜（DOCLAB 公司Cat No.16220405），anti E⁃cadherin（美国Bioworld 公司），Antiα⁃SMA（Cell Signaling，美国；编号19245），anti Collagen I（美国abcam；编号AB90395），anti PI3K，anti p⁃PI3K（Sigma 公司，美国），antiAkt（武汉Protec⁃tech；编号60203⁃2），anti⁃pAkt（美国Cell Signaling；编号4060），antimTOR（美国AbCam；编号AB32028），anti⁃HIF⁃1α，anti⁃GAPDH，antip⁃mTOR（美国AbCam公司），antiGapdh（武汉Protectech；编号10494⁃1），BEZ235 抑制剂（Selleck 美国CAS915019⁃65⁃7），Matrigel 胶（Affinity 美国），逆转录及PCR 反应体系购自上海申能博彩生物科技有限公司。……