诱导烟草抗灰霉病的茉莉酸甲酯有效浓度筛选

李林倩，余朝阳，陈 业，张秀榆，孔 琼，袁盛勇，薛春丽，陶宏征

（红河学院/云南省高校滇南特色生物资源研究与利用重点实验室，云南蒙自 661199）

烟草灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的真菌性病害，主要危害苗期和大田期的烟叶。当湿度较大时，叶片和幼茎密生有灰色霉层，严重时发病率可达100%。[1-2]该病目前仍以化学防治为主，但由于灰葡萄孢变异大、易产生抗药性等特点使化学防效较低，且化学药剂的大量使用不仅造成环境污染，还降低烟草品质。[3]因此开展烟草灰霉病的绿色防控尤为重要。而植物诱导抗性因其抗病的系统性、持久性和广谱性等优点，已成为防治植物病害的新思路。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作为一种植物激素信号分子广泛存在于植物体中，外源利用能诱导植物产生化学防御，激发相关基因表达。[4]大量研究发现MeJA与植物抗病性有相关性，且参与了植物局部或系统抗性[5]，施用外源MeJA能诱导植物对病原真菌、细菌、线虫产生抗病性，如诱导紫花苜蓿抗根腐病（Fusarium oxysporum）[6]、诱导辣椒抗青枯病（Ralstonia solanacearum）[7]、也能提高番茄果实对链格孢霉（Alternaria solani）等病原菌的侵染。[8]因此，本研究以MeJA为外源诱导物，筛选出对烟草灰霉病具有较好抗性的最佳浓度、持效期和接种时间，以期为茉莉酸甲酯指导烟草灰霉病防治提供理论数据。

1.材料与方法

1.1 材料

烟草BY-2品种和灰葡萄孢菌种均保存于红河学院生命学院305室。灰霉菌培养采用PSA固体培养基进行暗培养，温度为24±1℃，7d后取菌落边缘的菌丝块用于菌丝生长试验，同时收集孢子进行孢子悬浮液制备。烟草先用漂浮育苗后移栽，直至烟苗长为7叶1心期时接种使用。茉莉酸甲酯（北京索莱宝科技有限公司）先用少量无水乙醇溶解，再用无菌水配成所需浓度，浓度梯度为0.01mM、0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM。

1.2 方法

1.2.1 MeJA对灰葡萄孢的影响

分别测定了不同浓度茉莉酸甲酯对灰葡萄孢菌孢子萌发和菌丝生长的影响。（1）将上述5个浓度梯度的MeJA孢子悬浮液置于24±1℃暗培养，每隔12h观察孢子的萌发情况，连续观察3次，统计孢子萌发率，以灭菌水为对照。（2）PSA固体培养基制成含MeJA分别为上述5个浓度梯度的平板，对照为不含MeJA的PSA平板。平板中央接入直径为6mm菌丝块，于24±1℃暗培养，5d后测量菌落直径，计算抑菌率，每个处理3次重复。抑菌率（%）=（对照菌落生长量-处理菌落生长量）/对照菌落生长量×100 %。结果采用SPSS17.0进行显著性分析。

1.2.2 MeJA诱导烟草抗灰霉病的最佳浓度筛选

于不同浓度MeJA溶液中加入0.05%（V/V）Tween-80，再用喷雾器将不同浓度MeJA溶液喷施于烟草叶片上（叶片正反面均匀喷雾，药液不流淌为宜），对照仅用无菌水和0.05%（V/V）Tween-80喷雾处理。12 h后用浓度为1×106个/mL灰葡萄孢孢子悬浮液喷施于上述处理的烟草叶片（叶片正反面均匀喷雾，孢子液不流淌为宜），接种后避光保湿24h，并置于温度25±2℃和湿度为85%人工气候箱中培养，于第10d调查灰霉病发病情况，根据表1进行分级[9]，计算病情指数和诱抗效果，每个处理调查5个叶片，3次重复。

表1 灰霉病病斑的分级标准

公式为：病情指数＝（∑病级叶数×该病级值／调查总叶片数×最高级数值）×100

诱抗效果＝（对照病情指数－处理病情指数）／对照病情指数×100%

1.2.3 MeJA处理后诱导期及抗灰霉病持久性的测定

根据1.2.3结果，于MeJA溶液最佳浓度处理后每天喷上浓度为1×106个/mL灰葡萄孢孢子悬浮液于烟草叶片，叶片正反面均匀喷雾，液体不流淌为宜，接种后避光保湿24h，并置于温度25±2℃和湿度为85%人工气候箱中培养，接种8d后调查发病情况，进行病情指数和诱抗效果计算，确定最佳诱导期及持久性。每个处理调查5个叶片，3次重复。

2 结果与分析

2.1 茉莉酸甲酯对灰葡萄孢生长的影响

由图1可以看出，灰葡萄孢孢子在5个MeJA浓度下均能萌发和生长，各处理差异不显著（p＜0.05）。在处理后的12-36 h间，灰葡萄孢孢子随着时间延长，其孢子萌发率随之增高，且于36h达到最大值；且在同一MeJA浓度处理下，不同时间下的孢子萌发率差异不显著。同时灰葡萄孢菌丝块在含有不同浓度MeJA生长5d后，各处理间菌落抑制率不显著（见图1中的抑制率）。因此表明，MeJA对灰葡萄孢生长无影响。

图1 不同浓度MeJA对灰葡萄孢孢子萌发和菌丝生长的影响

2.2 不同浓度MeJA对烟草抗灰霉病诱抗效果

通过活体接种试验，没有喷施MeJA烟草植株叶片发病率最高达100 %。病斑初期呈水渍状，接着迅速扩展，最后形成黄褐色且边缘不规则的轮纹。不同浓度MeJA处理后，均能不同程度地降低烟草灰霉病的病情指数，且在浓度为0.01-0.50mM处理后能有效诱导烟草对灰葡萄孢菌产生抗性。但不同浓度MeJA产生的诱抗效果不同，其中0.1mM MeJA处理后的诱抗效果最好，高达52.29%，病情指数显著低于对照和其它浓度下的处理（见表2）。但是当MeJA为1mM时，烟草灰霉病的病情指数与对照相等，没有表现出诱抗效果，表明MeJA诱导烟草抗灰霉病的浓度并不是越高越好。

表2 不同浓度茉莉酸甲酯处理对烟草灰霉病的影响

2.3 MeJA诱导烟草抗灰霉病的最佳间隔期和持久期

在最佳MeJA浓度（0.1mM）处理下，连续8d观测了烟草灰霉病的病情指数，并进行诱抗效果统计。根据图2结果，发现处理时间不同，其发病情况和诱导抗病效果也不一样；在处理后1-4d间，灰霉病的病情指数逐渐降低且诱抗效果增加，其中第4d诱抗效果最好，病斑最小，病情指数最低；而处理后5-8d，灰霉病的病情指数又急速增加，且于第8d无诱抗效果。因此用0.1mM MeJA诱导烟草抗灰霉病的最佳间隔期为4d；而但处理间隔8d时，几乎无诱抗效果，这说明MeJA诱导烟草抗灰霉病的持久期可达7d左右。

图2 不同诱导时间下的烟草灰霉病病情指数和诱抗效果

3 小结与讨论

茉莉酸甲酯（MeJA）作为一种抗逆信号物质，能提高植物抗病害的能力。[10]但其诱导抗性高低与寄主植物品种、病害种类和茉莉酸甲酯浓度相关。当采用不同浓度MeJA喷雾辣椒幼苗后，0.1 mM 能明显诱导粤红1号幼苗抗青枯病（Ralstonia solanacearum），0.05mM对辛香8号的诱导效果最好[7]。而在紫花苜蓿根腐病（Fusarium oxysporum）的防治试验中，其根腐病病情指数的高低与外源MeJA浓度、紫花苜蓿品种和诱导时间相关，其中MeJA 浓度是主要因素，但MeJA浓度为0.1mg/mL时抑制效果最佳。[6]当用1g/mL MeJA喷雾4叶期的烟草幼苗后，该处理能提高幼苗抗炭疽病（Colletotrichum destructivum）的能力。[5]

本文通过茉莉酸甲酯5个不同浓度对烟草灰霉病诱抗检测发现，当喷施外源不同浓度茉莉酸甲酯均能不同程度减低烟草灰霉病的发生，而不是直接的抑菌作用；MeJA浓度为0.1 mM时，病斑最小，烟草灰霉病的病情指数最低，诱抗效果最高为（52.29±3.13）%；当0.1 mM MeJA处理后第1d就表现出诱抗效果，且持续至第7d，这说明MeJA对诱导烟草产生抗性有着较好持久性。尤其喷施后的第4d，烟草叶片的病斑最小，病情指数最低，同时表现出最大的诱抗效果为69.90%。因此，MeJA诱导烟草灰霉病的最佳间隔期是4d，持久期可达7d左右，且植物诱导抗性的产生需要一定时间，在烟草灰霉病的大田防治中，需要在病害发生之前喷施MeJA才能起到较好的防治作用。