自制实时定量PCR试剂在基因扩增中的效果评价

＊姬丽娟 李倩 李汉超 郝志明

（西安交通大学 陕西 710000）

引言

实时定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR），PCR聚合酶联反应是体外选择性扩增特定基因片段技术，被广泛应用临床基因诊断、食品安全、环境污染检测，该项技术能够准确的获取基因片段，且特异性、灵敏度高，是目前检测核酸拷贝数的可靠方法之一。

1.Taq DNA聚合酶的制备

(1)Taq-DNA聚合酶的表达

取pTaq质粒lμL与感受态大肠杆菌E coli DH5a菌株进行混合，冰浴30min，42℃水浴90s，然后冰浴5min，进行质粒的热休克。加入500μL不含氨苄青霉索（Amp）的LB液体培养基，37℃振荡培养2h。取100μL培养液均匀涂布在含有100μg/mL氨苄青霉（Amp）的LB固体培养基，置于37℃培养箱中，培养24h，挑选阳性重组克隆。转接于Amp浓度为100μg/mL的5mL LB液体培养基，37℃、180r／min培养2h（OD600=0.4）后，加入100μL IPTG（1mol/L），37℃180r/min振荡培养6h，诱导Taq-DNA聚合酶基因的表达。

(2)Taq DNA聚合酶的提取和纯化

3500rpm离心10分钟收集菌体，按10:1体积加入重悬液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L DTT，10%甘油）重悬沉淀，具体纯化过程参考文献刘钦松重组Taq DNA聚合酶的表达和纯化鉴定。

(3)重组Taq DNA聚合酶的活性测定

PCR反应体系总体积为20μL，反应组成为：商品化的10×PCR buffer 2μL，引物F（20μM）0.2μL，引物R（20μM）0.2μL，模板pAAV-LacZ 0.5μL，MgCl2（20mmol/L）2μL，d NTP（2.5mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（0.1μL，0.5μL，1μL，2μL），灭菌ddH2O补足20μL。即用不同浓度纯化的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增实验，以市售商品化的Taq DNA聚合酶（天根）1U为对照。通过比较扩增产物电泳条带的亮度估算纯化的酶活性及用量，用于后续实验的PCR扩增。

根据引物CMV（正向引物F：5'-GCGTGGATAGCGGTTTGACT-3'反向引物R：5'-CAATGGGGCGGAGTTGTT-3'）确定扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，30个循环。循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳仪进行检测产物质量。

2.实时定量PCR mix的配置及条件优化

(1)配置实时定量PCR mix

参照EvaGreen染料说明书以及文献配方，自制的10×PCR buffer配置方法如下：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5% Triton X-100。……