17%吡唑醚菌酯·氟环唑悬浮剂的高效液相色谱分析方法

何培迎，陈宏祥，仲春梅

(江苏蓝丰生物化工股份有限公司，江苏 新沂 221400)

氟环唑是一种内吸性三唑类杀菌剂，能抑制病菌麦角甾醇合成，阻碍病菌细胞壁的形成，并且氟环唑分子对一种真菌酶具有强力亲和性，与目前已知杀菌剂相比，能够有效抑制麦角甾醇合成[1]。还可提高作物几丁质酶活性，导致真菌吸气收缩，抑制病菌侵入，这是氟环唑在所有三唑类产品中独一无二的特性。吡唑醚菌酯对病原真菌的线粒体呼吸具有抑制作用，即通过在细胞色素合成中阻止电子转移抑制线粒体的呼吸，干扰细胞能量供给，使细胞死亡，从而发挥杀菌作用。对几乎所有真菌类(子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类)病害都显示出很好的活性。具有保护和治疗作用，并有良好的渗透和內吸作用[2]。

吡唑醚菌酯·氟环唑悬浮剂作为一种新型广谱复配杀菌剂，对大田作物、水果、蔬菜的多种病害兼具治疗、铲除作用，尤其对小麦赤霉病、锈病的防治效果显著、持效期长，对小麦安全，应用前景广阔。目前，关于氟环唑、吡唑醚菌酯以及其他复配制剂的检测方法均有报道[3-6]，但有关17%吡唑醚菌酯·氟环唑复配制剂的高效液相色谱分析方法未见报道。本文建立的HPLC方法，以甲醇+0.2%磷酸水溶液为流动相，采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱和可变波长紫外检测器，对有效成分吡唑醚菌酯和氟环唑同时分离、定量。该方法可供检测机构和企业分析室人员监督和把控吡唑醚菌酯·氟环唑复配制剂的质量时作参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 岛津高效液相色谱仪LC-20A，可变波长紫外检测器，色谱工作站；甲醇(HPLC)；超纯水制备系统；吡唑醚菌酯(99.0%)标样和氟环唑(99.0%)标样，国家农药质量监督检验中心(沈阳)。17%唑醚·氟环唑悬浮剂。

1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18不锈钢柱(250mm×4.6mm，粒径5μm)；检测波长235nm，流动相：ψ(甲醇+0.2%磷酸水溶液)=75+25；流速：1.0mL/min；进样体积10μL；柱温：室温(温差变化≤2℃)；保留时间：氟环唑约6.9min；吡唑醚菌酯约9.5min(图1、图2)。

图1 吡唑醚菌酯和氟环唑对照品高效液相色谱图

图2 17%吡唑醚菌酯·氟环唑悬浮剂试样高效液相色谱图

1.3 测定步骤

1.3.1 标样溶液配制 在50mL容量瓶中，称取0.06g吡唑醚菌酯标样、氟环唑标样0.03g(均精确至0.000 1g)置于同一50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。用移液管准确吸取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤(0.45μm微孔滤膜)，滤液备用。

1.3.2 试样溶液的配制 称取0.5g被试物(精确至0.000 1g)置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。用移液管准确吸取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤(0.45μm微孔滤膜)，滤液待测。

1.3.3 测定 当仪器基线稳定后，在优化的试验条件下，使标样溶液连续进样，直至相邻2针吡唑醚菌酯(或氟环唑)峰面积的相对变化<1.2%后，再按照标样溶液、被试物溶液、被试物溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.3.4 计算 将试验测得的2针被试物溶液以及前后2针标样溶液中吡唑醚菌酯(或氟环唑)的峰面积分别进行平均。被试物中吡唑醚菌酯(或氟环唑)的质量分数ω(%)按式(1)计算：

(1)

式中：

A1——标样溶液中，吡唑醚菌酯(或氟环唑)峰面积的平均值；

A2——试样溶液中，吡唑醚菌酯(或氟环唑)峰面积的平均值；

m1——吡唑醚菌酯(或氟环唑)标样的质量，g；

m2——试样的质量，g；

ω——标样中吡唑醚菌酯(或氟环唑)的质量分数，%；

2 结果与分析

2.1 色谱条件选择

2.1.1 色谱分离条件选择 试验过程中，反复比对被试物吡唑醚菌酯和氟环唑与标样在波长190～400nm范围内的紫外吸收光谱曲线，同时考虑溶剂峰、杂质峰干扰以及各组分的灵敏度、分离度和数据稳定性，最终确定最适检测波长为235nm。

2.1.2 色谱柱及流动相的选择 为保证快速检测有效成分吡唑醚菌酯和氟环唑且峰形良好，选择150mm×4.6mm：Agilent ZORBAX XDB-C18不锈钢柱和250mm×4.6mm：AgilentEclipse XDB-C18不锈钢柱分别进行研究，采用不同比例的甲醇-水和乙腈-水作为流动相，均未得到良好的分离度。经分析比较，发现在酸性条件下被测组分相对稳定。添加不同浓度的冰乙酸和磷酸，最终选择250mm×4.6mm AgilentEclipse XDB-C18不锈钢柱，并采用磷酸作为减尾剂，确定流动相为甲醇+0.2%磷酸水溶液(体积比75+25)，流量为1.0mL/min。该测定保留时间适中，实现吡唑醚菌酯和氟环唑的有效分离，且峰形良好。

2.2 线性相关性 配制不同质量浓度的标样溶液，在优化的色谱分离条件下进行测定。横坐标为吡唑醚菌酯(氟环唑)的质量浓度，纵坐标为其峰面积值。二者线性回归方程和相关系数分别为：Y吡唑醚菌酯(氟环唑)=1E+08x，r=0.999。吡唑醚菌酯定量线性关系在0.1～0.6mg/mL质量浓度下良好；氟环唑定量线性关系在0.02～0.25mg/mL质量浓度下良好结果，(图3、图4)。

图3 吡唑醚菌酯线性关系图

图4 氟环唑线性关系图

2.3 方法的精密度 试验采用5批次的被试物17%吡唑醚菌酯·氟环唑悬浮剂，连续重复测定5次，研究了定量分析方法的精密度，结果(表1)。吡唑醚菌酯和氟环唑的变异系数分别是0.65%和0.51%，满足被试物定量分析的要求。

表1 精密度测定

2.4 方法的准确度 试验采用产品空白制剂中添加不同浓度的吡唑醚菌酯和氟环唑标样的方法，配制5份与被试物相近的模拟样品，开展添加回收率试验，研究方法的准确度。试验数据表面吡唑醚菌酯添加回收率为99.70%～99.96%，氟环唑添加回收率为99.20%～99.78%，两者平均回收率分别为99.78%和99.45%(表2)，准确度较高，可以满足定量分析要求。

表2 准确度测定数据

2.5 特异性鉴定 按照1.3.1/1.3.2所述方法配制标准溶液和样品溶液，在1.2操作条件下采用HPLC-DAD峰纯度分析法对氟环唑、吡唑醚菌酯进行鉴别，特异性典型谱图(图5、图6)。由谱图可知，氟环唑、吡唑醚菌酯在该分析方法下对紫外光有较强的吸收信号。从色谱图可以清晰的看出，有效成分氟环唑、吡唑醚菌酯处无其他物质干扰，符合定量分析要求。

图5 氟环唑特异性鉴定

图6 吡唑醚菌酯特异性鉴定

2.6 非分析物干扰的判定 在评价准确度时，需要包含非分析物质干扰试验，因为助剂中的任何干扰物均会导致分析方法出现系统偏差，分析时同时测定不带助剂的原药和空白样品，证明其无相互干扰，并提交相关色谱图。通过不加助剂的原药色谱图和空白样品色谱图判定，非分析物对有效成分氟环唑、吡唑醚菌酯的分析不构成干扰，相关非分析物质干扰典型谱图(图7～图9)。

图7 空白样品图8 氟环唑

图9 吡唑醚菌酯

3 结论

综上，本文建立的HPLC分析方法，保留时间合理，精密度与准确度较高，可快速分离及测定吡唑醚菌酯·氟环唑制剂中两种有效成分的含量，且线性相关性好，适用于检测机构和企业分析室对吡唑醚菌酯·氟环唑复配制剂质量的监督与把控。