MiR-195-5p对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响及作用机制研究

张 碟，刘祥贺，霍苗苗，刘 梅，徐宁志，朱红霞

(国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021)

食管癌是世界高发恶性肿瘤之一，食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌最主要的组织学类型，在发展中国家更为常见，东亚是高发地区，主要分布在中国。手术切除是食管鳞癌患者的首要治疗方法，并提供了治愈的最佳机会，但由于大多数食管鳞癌患者确诊时已属晚期，伴有远处或淋巴结转移，失去了手术机会，因此食管癌患者的总体预后不理想，5 年生存率仅为17%左右。对于不能手术切除的食管癌患者，放射治疗可以显著提高患者生存，已经成为一种重要的治疗手段。然而食管鳞癌对放射治疗的敏感性并不理想，而且对于放射的抵抗会导致治疗失败，因此在临床应用方面迫切需要提高放射敏感性的方法，了解食管癌放射抵抗的相关机制。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与其靶基因mRNA 的 3′端非翻译区(the 3′ untranslated region，3′UTR)结合，抑制靶基因mRNA的翻译或稳定性，参与基因表达调控。最近的研究表明，miRNA在辐射诱导的基因表达、细胞信号事件和损伤反应通路的调控中发挥着重要作用，miRNA已被证明可以调节辐射敏感性，可能作为评估和监测肿瘤放射敏感性以及调节放疗反应的候选分子。近年来，许多研究报道了不同类型细胞的miRNA在放疗时表达的变化，以及各种miRNA 在细胞辐射敏感性中的具体作用。MiR-195是miR-15/107家族成员，在不同类型的肿瘤中发挥促癌或者抑癌作用。MiR-195 在食管癌患者肿瘤组织中的表达显著降低，提示miR-195可能在食管癌的发生发展中发挥抑癌基因的作用。然而关于miR-195-5p与食管癌关系的研究仍较少。本研究旨在探讨miR-195-5p对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响及其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂

食管鳞癌细胞系KYSE510、KYSE150 由日本Shimada Y 博士惠赠。RPMI 1640 培养基购自北京细工公司，胎牛血清购自ExCell Bio 公司，RIPA buffer、抗survivin抗体购自CST公司，抗GAPDH抗体购自 Proteintech 公司，BCA Protein Assay Kit 购自Thermo Scientific 公司，Trizol 试剂及 Lipofectamine3000 转染试剂购自Invitrogen 公司，PrimeScriptRT Master Mix 反转录试剂盒购自日本TaKaRa 公司，riboSCRIPT Reverse Transcription Kit 购自锐博(广州)生物技术有限公司，Power SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒购自 Applied Biosystems 公司，Enlight显色剂购自Engreen Biosystem 公司。内参GAPDH 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。MiR-195-5p 和 U6 的 Bulge-LoopTM RT 引物，miR-195-5p 的类似物，拮抗物及各自的阴性对照片段均由锐博(广州)生物技术有限公司设计合成。Cell Counting Kit-8 及Annexin V，FITC 凋亡检测试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司。BeyoClickEdU-594 细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。Dualluciferase reporter assay system(E1960)试剂盒购自Promega 公司。BIRC5 3′ UTR 报告基因质粒及 pGL3阴性对照质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.2 细胞培养及放射线照射

用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 培养液培养 KYSE510 和KYSE150 细胞，并置于37 °C、CO体积分数为5%的恒温培养箱内，每隔1～2 d 换液，细胞生长至汇合度为80%左右时，使用0.05%的胰蛋白酶消化细胞，传代培养。将处于对数生长期的细胞消化计数，制成适宜浓度的单细胞悬液后接种于孔板中，待细胞贴壁后，采用X 射线(MultiRad)以源皮距SSD=100 cm，按3 Gy/min 的剂量率对细胞进行不同剂量(4 或8 Gy)的照射，以未照射细胞为对照。

1.3 细胞转染

将KYSE510和KYSE150细胞按3×10个/孔接种于6孔板中培养24 h，细胞生长至汇合度为70%～80%时进行转染，转染前1 h 更换不含抗生素的RPMI 1640培养液培养，采用Invitrogen 公司的Lipofectamine3000进行细胞转染，具体操作按说明书进行。分别将4 μL 20 μmol/L 的miR-195-5p类似物、miR-195-5p拮抗物或阴性对照片段加入120 μL Opti-MEM中稀释混匀，室温静置5 min，同时用120 μL 的Opti-MEM稀释4 μL转染试剂Lipofectamine3000，然后分别将稀释后的miR-195-5p 类似物、拮抗物或阴性对照片段加入到稀释后的Lipofectamine3000 试剂中轻轻吹打混匀，室温静置15 min，最后逐滴均匀加入到孔板中，37 ℃培养24 h后进行后续实验。

1.4 细胞分组

研究RNA 表达水平时，对KYSE510 和KYSE150细胞进行8 Gy 的X 射线照射，另以未照射细胞为对照，于照射后24 h 检测两组细胞中miR-195-5p 的表达水平；将转染miR-195-5p 类似物、拮抗物或相应阴性对照片段的KYSE510 细胞用8 Gy 的X 射线照射，于照射后24 h 检测各组细胞中survivin mRNA 的表达水平。

研究蛋白表达水平时，对KYSE510和KYSE150细胞进行8 Gy 的X 射线照射，另以未照射细胞为对照，于照射后不同时间(1、6、12、24 和72 h)检测两组细胞中survivin 蛋白的表达变化；将转染miR-195-5p 类似物、拮抗物或相应阴性对照片段的KYSE510 和KYSE150 细胞用8 Gy 的X 射线照射，于照射后24 h检测各组细胞中survivin蛋白的表达水平。

1.5 CCK-8法检测细胞生长情况

将KYSE510 或KYSE150 细胞分别接种于96 孔板中，每孔1 000个，置于37 ℃、CO体积分数为5%的恒温培养箱中培养12 h 后，分别用4 Gy 或8 Gy 的X 射线照射细胞，以未照射细胞为对照，继续培养4 d，吸去培养液，加入CCK-8 溶液，用酶标仪分别在照射后1～4 d每天检测1次在450 nm处的吸光度值

D

(450)。

1.6 实时荧光定量PCR 法检测细胞miR-195-5p 和survivin mRNA表达水平

用Trizol 裂解法提取各组细胞总RNA，对于mRNA使用PrimeScriptRT Master Mix逆转录试剂盒合成cDNA，对于miRNA 使用riboSCRIPT Reverse Transcription Kit 进行逆转录合成cDNA。定量PCR 使用 Power SYBR Green PCR Master Mix 按照 20 μL 体系(10 μL Mix、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、1 μL cDNA 和 7 μL HO)加样。以 GAPDH 作为 mRNA的内参基因，以U6作为miRNA的内参基因。qPCR扩增程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 个循环。用 2法计算mRNA 的相对表达水平。mRNA 引物由生工公司合成，其序列如下：survivin，正向引物5′-AGGACCA CCGCATCTCTACAT-3′，反向引物 5′-AAGTCTGGCT CGTTCTCAGTG-3′；GAPDH，正向引物5′-GTGAAG GTCGGAGTCAACGG-3′，反向引物 5′-CTCCTGGAA GATGGTGATGGG-3′。

1.7 Western blot检测survivin蛋白表达水平

用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白检测试剂盒进行定量，电泳分离后运用湿转法将蛋白质转移到NC 膜上。用抗survivin 抗体(1∶1 000 稀释)4 ℃孵育过夜，显色后使用化学发光成像仪曝光。

1.8 Incucyte实时动态活细胞监测

将转染miR-195-5p 类似物、拮抗物或阴性对照片段24 h 后的KYSE510 细胞接种于96 孔板中，每孔4 000个，24 h后用8 Gy的X射线照射细胞，另设未照射细胞为对照。继续培养72 h，用Incucyte S3监测细胞的实时动态，每3 h 记录一次细胞的生长状态。用细胞生长汇合度衡量细胞数量，汇合度低表示细胞数量少，而汇合度高则代表细胞数量多。

1.9 EdU掺入实验

将KYSE510 细胞按 3×10个/孔接种于 6 孔板中培养24 h，分别转染miR-195-5p 的类似物和阴性对照片段，24 h 后将细胞消化计数，以每孔2 000 个细胞接种于96 孔板中培养24 h 后，用8 Gy 的X 射线照射细胞，另设未照射细胞为对照，继续培养细胞5 d后，使用BeyoClickEdU-594细胞增殖检测试剂盒染色。用高内涵筛选仪器(Operetta)进行荧光检测。EdU阳性细胞/Hoechst 阳性细胞比例代表细胞的增殖能力，比值大代表增殖能力强，比值小代表增殖能力弱。

1.10 克隆形成实验

将转染miR-195-5p 类似物、拮抗物或相应对照片段24 h 后的KYSE510 细胞接种于6 孔板中，每孔500个细胞，培养24 h后，用4 Gy X射线照射，另设未照射细胞为对照，孵育14 d后，固定染色，显微镜下计数＞50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。

1.11 流式细胞术检测细胞凋亡率

对转染miR-195-5p 类似物或阴性对照片段24 h后的KYSE510 细胞用8 Gy 的X 射线照射，另设未照射细胞为对照，继续培养7 d 后用凋亡检测试剂盒标记Annexin V-FITC 和碘化丙锭(PI)，进行流式细胞术检测，将Annexin V-FITCPI和Annexin V-FITCPI两个象限的细胞占总细胞数的比例相加，即为细胞凋亡率。

1.12 双荧光素酶报告基因实验

将KYSE150 细胞接种于24 孔板中，每孔80 000个细胞，培养24 h后，用Lipofectamine3000瞬时共转染20 pmol miR-195-5p 类似物或阴性对照片段，以及 200 ng BIRC5 3′ UTR 报告基因质粒或 pGL3 阴性对照质粒。转染24 h后，各转染组细胞用8 Gy的X射线照射，另设未照射细胞为对照，48 h 后裂解细胞，根据说明书，采用双荧光素酶报告检测系统(Promega)测定荧光素酶活性。

1.13 统计学分析

各实验均进行3 次重复。统计分析采用GraphPad Prism 7 软件，照射组、未照射组；miR-195-5p 类似物组、拮抗物组及阴性对照组细胞间各种指标差异的比较，采用

t

检验(Student's

t

test)，以

P

＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 X 射线照射后食管鳞癌细胞的生长情况及miR-195-5p和survivin蛋白的表达

食管鳞癌细胞KYSE510 和KYSE150 经4 和8 Gy的X射线照射后，CCK-8实验检测其生长情况，结果见图1，两株细胞的生长均受到明显抑制。

图1 CCK-8法检测食管鳞癌细胞接受X射线照射后的生长情况

KYSE510 和 KYSE150 细胞经过 8 Gy X 射线照射后24 h，qPCR检测miR-196-5p的表达水平，结果见图2，与未照射组细胞相比，两株照射组细胞中miR-195-5p的表达水平显著均下降(

P

＜0.05或0.01)。

图2 qPCR检测食管鳞癌细胞接受8 Gy X射线照射后miR-195-5p的表达水平

KYSE510 和 KYSE150 细胞经过 8 Gy X 射线照射后 1、6、12、24、72 h，Western blot 检测 survivin 蛋白的表达水平，结果见图3，显示KYSE510 细胞在照射后12、24、72 h，KYSE150 细胞在照射后24 h，survivin 蛋白的表达水平均高于未照射组细胞(均为

P

＜0.01)。

2.2 MiR-195-5p影响食管鳞癌细胞的放射敏感性

Incucyte实时动态活细胞监测结果见图4，与阴性对照组相比，转染miR-195-5p 类似物组的KYSE510细胞增殖速度减慢；经8 Gy X 射线照射后，转染miR-195-5p类似物组细胞增殖速度显著降低。计算同一时间点相同处理的照射组细胞汇合度与未照射组细胞汇合度的比值，可表示细胞经X射线照射后的相对存活率(图4B)，结果显示转染miR-195-5p 类似物组KYSE510细胞的相对存活率较阴性对照组显著降低。

EdU掺入实验结果见图5，显示经8 Gy X射线照射后转染miR-195-5p 类似物组KYSE510 细胞EdU 阳性率低于类似物对照组(

P

＜0.05)，而转染miR-195-5p拮抗物组KYSE510细胞EdU阳性率显著高于拮抗物对照组(

P

＜0.01)。

图3 Western blot检测食管鳞癌细胞接受8 Gy X射线照射后survivin蛋白的表达情况

图4 转染miR-195-5p类似物组KYSE510细胞经X射线照射后的增殖和存活情况

图5 经X射线照射后转染miR-195-5p类似物组、拮抗物组KYSE510细胞的增殖情况

克隆形成实验结果见图6，显示转染miR-195-5p类似物组KYSE510 细胞经4 Gy X 射线照射后的克隆形成率显著低于类似物对照组(

P

＜0.01)，而转染miR-195-5p拮抗物组KYSE510细胞经X射线照射后的克隆存活率则高于拮抗物对照组(

P

＜0.01)。

图6 经X射线照射后转染miR-195-5p类似物组、拮抗物组细胞的克隆形成能力

流式细胞术检测结果见图7，显示经8 Gy X射线照射后转染miR-195-5p 类似物组KYSE510 细胞的凋亡率较阴性对照组显著升高(

P

＜0.01)。

图7 经X射线照射后转染miR-195-5p类似物组细胞的凋亡情况

2.3 MiR-195-5p靶向调控survivin蛋白的表达

通过TargetScan Human 网站预测人BIRC5 3′UTR 的 95～101 nt 为 miR-195-5p 的假定结合位点(图8A)， 在 TCGA 数 据 库 中 ， miR-195-5p 与 survivin mRNA 的表达水平在食管癌中呈负相关(

P

＜0.01，图8B)。qPCR 实验结果显示X 射线照射后24 h，与阴性对照组相比，转染miR-195-5p 类似物组KYSE510 细胞中survivin mRNA 表达水平显著下降(

P

＜0.01)，而转染miR-195-5p 拮抗物组的KYSE510 细胞中survivin mRNA 水平显著升高(

P

＜0.05，图 8C)。Western blot 实验结果显示，与相应的对照组比较，转染miR-195-5p类似物组KYSE510 和KYSE150 细胞在接受8 Gy X 射线照射后24 h，survivin 的表达受到抑制，而转染miR-195-5p 拮抗物组细胞经照射后则会促进survivin的表达(图8D)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，在KYSE150 细胞中过表达miR-195-5p 能够抑制BIRC5 3′ UTR的荧光素酶活性(

P

＜0.01，图8E)。以上结果表明，在食管鳞癌细胞中，miR-195-5p能够靶向抑制survivin的表达。

3 讨 论

放射抵抗被认为是放疗后局部失败和肿瘤复发的重要原因，有证据表明，miRNAs 调节介导辐射反应的关键细胞信号通路，有可能作为新的治疗策略的开发目标来克服肿瘤的辐射抗性。越来越多的证据表明miRNAs 可以影响细胞对辐射的反应。Lv 等研究证明辐射可通过上调肺癌细胞中miR-155的表达，诱导己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)高表达及糖酵解增强，导致肺癌细胞的放射抵抗。Chen 等研究表明miR-18a-5p 可通过下调ATM 和HIF-1α的表达，增强肺癌细胞和CD133干细胞的放射敏感性。然而miRNA关于食管癌放射敏感性的研究还比较少。

图8 食管鳞癌细胞中miR-195-5p靶向调控survivin的表达

MicroRNA 可以作为癌基因或抑癌基因，通过靶向肿瘤相关基因在食管癌的发生发展过程中发挥作用。研究发现miR-195 在多种恶性肿瘤中的表达均下调，包括乳腺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌和肾上腺皮质癌等。MiR-195在肺癌中表达明显下调，miR-195的异位表达能显著抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力，并且在裸鼠异种移植模型中miR-195也可以抑制肿瘤的生长。很多研究发现，与正常食管组织相比，miR-195 在食管鳞癌细胞中的表达显著降低，并且过表达miR-195-5p 可以抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。

非小细胞肺癌细胞接受放射线照射后miR-195的表达水平明显降低，过表达miR-195可通过抑制细胞增殖和诱导凋亡来增强非小细胞肺癌的放射敏感性。本研究结果显示，食管鳞癌细胞接受放射线照射后miR-195-5p 的表达水平降低，转染miR-195-5p类似物组的细胞存活率较阴性对照组显著降低(

P

＜0.01)，凋亡率较阴性对照组显著升高(

P

＜0.01)，而转染miR-195-5p 拮抗物组的细胞存活率较阴性对照组升高(

P

＜0.01)，表明过表达miR-195-5p 能通过抑制细胞增殖和诱导凋亡来增强食管鳞癌的放射敏感性。本研究结果证明miR-195-5p 也可通过抑制细胞增殖和诱导凋亡增强食管鳞癌细胞的放射敏感性。生物信息学预测表明，miRNAs 调控着人类基因组中大约30%基因的表达。miRNA 与多种生物学功能和病理过程密切相关，包括细胞增殖、分化、凋亡和自我更新。为探讨放射线照射抑制miR-195-5p导致放射拮抗的分子机制，需要进一步寻找miR-195-5p所调控的基因。Itesako等的研究首次证明survivin可能受膀胱癌细胞中miR-195/497 簇的调控，Yu 等的研究证明miR-195可直接靶向survivin诱导非小细胞肺癌的凋亡和衰老。本研究的分析提示TCGA 数据库中miR-195-5p 与BIRC5 mRNA 表达水平在食管癌中呈负相关，并且在BIRC5 3′ UTR中有miR-195-5p的结合位点。进一步研究结果显示，食管鳞癌细胞接受放射线照射后，miR-195-5p 表达下降，而survivin 的蛋白表达水平显著升高。过表达miR-195-5p 可以抑制survivin 的mRNA 和蛋白表达水平，抑制miR-195-5p则survivin的mRNA和蛋白表达水平均升高。在基因转录水平过表达miR-195-5p能够抑制BIRC5 3′ UTR的荧光素酶活性(

P

＜0.05)，而在细胞经受X射线照射后这一抑制作用会显著增强(

P

＜0.01)。这些结果证明放射线照射抑制miR-195-5p 表达，进而导致survivin 的表达升高。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，在包括鳞癌在内的大多数恶性肿瘤中均过表达，这与不良预后、侵袭性肿瘤行为、耐药和高肿瘤复发率相关。Survivin能拮抗凋亡，促进肿瘤相关血管生成，并对各种抗癌疗法起到抵抗因子的作用，是肿瘤发病和复发的诊断生物标记物，也是癌症药物的有效靶点。因此，miR-195-5p 表达降低导致的survivin 表达升高可能是食管鳞癌放射抵抗的原因之一。

本研究在细胞水平证实了在食管鳞癌细胞中放射线照射可以通过抑制miR-195-5p 增强survivin 的表达，过表达miR-195-5p 可以通过靶向抑制survivin，降低细胞存活率，诱导细胞凋亡，从而增强食管鳞癌细胞的放射敏感性，这首次证明了miR-195-5p 在食管鳞癌放射治疗中的作用，并为miRNAs 在放射抵抗中的临床应用提供了理论基础，也为进一步研究miR-195-5p 在食管鳞癌放射敏感性中的作用奠定了基础。在接下来的工作中可以继续深入研究miR-195-5p 与食管鳞癌放射治疗的相互作用及机制，通过局部注射给药方式，使用miRNA 激动剂(agomir)在动物体内模拟高表达miRNA，进一步探索miR-195-5p作为预测食管鳞癌患者放疗应答和预后的潜在标志的可能，通过靶向干预miR-195-5p 的表达降低食管鳞癌患者的辐射抵抗，为食管鳞癌患者的靶向治疗提供新的思路。