Class2 CRISPR-Cas 系统发掘及分析方法

朱晓菲，黄娇媚，原 昊，万 逸,3

（1.海南大学 海洋学院/南海海洋资源利用国家重点实验室，海口 570228; 2.海南大学 信息与通信工程学院，海口 570228; 3.中国科学院 海洋研究所/山东省腐蚀科学重点实验室，山东 青岛 266071）

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated gene（CRISPR-Cas）全称为成簇的规律间隔的短回文重复序列，最初于1987 年在大肠杆菌中发现。ISHINO Y 等[1]在研究大肠杆菌iap（碱性磷酸酶）基因时，在其编码区3′端侧翼序列中发现长度为29 bp 高度保守的重复核苷酸序列，重复序列的间隔为32 bp。随着对该序列的深入研究，发现该重复序列广泛存在于古细菌和细菌的基因组中，直到2002 年JANSEN R 正式命名该重复序列为CRISPR 序列，除此之外，该研究还发现CRISPR基因的侧翼序列中有4 种同源基因（CRISPR-associated gene）：cas1、cas2、cas3、cas4，这些基因编码一些功能蛋白，与CRISPR有功能相关性[2]。随着深入研究，CRISPR-Cas 系统的功能的免疫功能逐渐被发现，CRISPR-Cas系统类似于真核生物的RNA 干扰（RNAi）[3]，后经证实是细菌对噬菌体等病原生物的获得性免疫作用[4]。CRISPR-Cas 系统在细菌对抗噬菌体侵入时分为3 个阶段。第1 阶段为适应阶段：在噬菌体侵入细菌时，Cas1-Cas2 蛋白复合物根据前间隔序列临近基序（PAM）位点将噬菌体靶DNA（protospacer）切割并将这段靶DNA 序列插入到CRISPR 重复序列5′端的末尾，产生新的间隔序列（spacer）。第2 阶段是基因的表达和处理阶段，间隔序列（spacers）和CRISPR 重复序列共同进行转录，形成初转录产物pre-CRISPR RNA（pre-crRNA），后由Cas 蛋白复合物对转录初产物进行切割，得到成熟的包含间隔序列（spacers）和重复序列的CRISPR RNAs（crRNAs）。不同的CRISPR-Cas 系统对pre-crRNA 的处理存在差异，有些由多个Cas 蛋白亚基处理，有的由单个Cas 蛋白处理，有的借助于宿主细胞的RNase。……