AN04-2治疗骨质疏松的成药性评价

宋燕 许元生 张时群 吴才梅 汤宇晴

广州领晟医疗科技有限公司，广东 广州 10667

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征，导致骨强度下降，脆性增加和易于骨折的代谢性骨病[1]。伴随人口老龄化，骨质疏松已成为全世界关注的老年疾病之一。研究表明，2016年中国60岁以上的老年人骨质疏松症患病率为36 %，其中男性为23 %，女性为49 %，骨质疏松症已成为我国面临的重要公共卫生问题[2]。骨质疏松患者骨折发生率高，可引起和加重心脑血管疾病等，对患者的生理、心理健康危害极大，并大大降低生活质量，也给社会带来了严重经济负担[3]。

骨质疏松治疗药物有很多，但绝大多数为骨吸收抑制剂(如雌激素受体调节剂[4]、双膦酸盐[5]、RANKL抑制剂[6]、降钙素[7]等)，而骨形成促进剂(如甲状旁腺素类似物[8]、阿巴帕肽[9]等)的种类却非常少。从药物的治疗效果来看，局限在改善症状，延缓病情发展的水平，尚未达到疾病改善甚至治愈的效果，故而现有治疗方式并不能满足临床需求。

AN04-2是新型的骨质疏松治疗药物，为骨关节炎治疗多肽LH021与人血白蛋白(HSA)的融合蛋白，具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，有可能用于骨质疏松的治疗。本研究的目的是评价AN04-2治疗骨质疏松的成药性，为进入临床前研究提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

野生型AB系斑马鱼，年龄为受精后3 d(3 dpf)，委托浙江杭州环特生物公司进行AN04-2治疗斑马鱼骨质疏松的研究；12周龄SD大鼠，雌性，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，委托澎立生物医药技术(上海)有限公司进行AN04-2治疗大鼠骨质疏松的研究。8周龄SD大鼠雌雄各半，体重180～220 g，购自中山大学试验动物中心，委托广州易沃路科技有限公司进行AN04-2单次给药毒性研究。

1.2 试剂与药品

重组人BMP-2 蛋白购自R&D公司，货号为355-BM/CF；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒，购自碧云天生物，货号为P0321；泼尼松，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号为A1508012；钙黄绿素(Calcein)，购自美国sigma公司，批号为C0875-5G；盐酸依替膦酸二钠水合物(简称依替膦酸二钠)，批号为MFCD00152567，由东京化成工业株式会社生产。特立帕肽注射液(PTH)，批号C879391D，生产厂家为法国Lilly，规格为2.4 mL/支。

1.3 AN04-2体外对人成骨细胞ALP表达的影响

方法参考文献[10-11]并有所改变：人成骨细胞hFOB1.19复苏后，加入MEM培养基，于5 %CO2、37 ℃、饱和湿度下培养至对数生长期。取对数生长期的hFOB1.19细胞，计数，调整细胞浓度为1*105个/mL，培养于96孔板，每孔100 μL，加入终浓度为0.1、0.3、1、3、10 μmol/L的AN04-2进行处理，以同体积的PBS作为阴性对照，40 ng/mL的骨形态发生蛋白2(BMP-2)作为阳性对照，处理7 d后，以碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测各组的ALP的表达。

1.4 AN04-2对斑马鱼骨质疏松模型的治疗作用

方法参考文献[12-14]并有所改变：随机选取受精后3 d正常野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每组30尾，用泼尼松诱导斑马鱼建立骨质疏松症模型，分别注射给予不同剂量的AN04-2(5、15、50 ng/尾)，注射体积为10 nL。同时设置正常对照组(即未经泼尼松诱导的斑马鱼)、模型对照组、阳性对照组，正常对照组与模型对照组均注射同体积的生理盐水，阳性对照组水体给予150 μg/mL的依替膦酸二钠，28 ℃培养箱孵育96 h后，用0.2 %钙黄绿素进行染色，染色后进行拍照并采集数据，分析统计斑马鱼脊椎骨荧光强度，以有统计学意义评价供试品对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松症的治疗作用。

1.5 AN04-2对大鼠骨质疏松模型的治疗作用

方法参考文献[15-18]并有所改变：12周龄雌性SD大鼠随机分为6组，每组10只。动物以1.5 %～3.0 %异氟烷麻醉后，碘伏消毒皮肤，在下腹中线作纵行切口，钝性分离皮下组织暴露腹正中线，在腹白线切开腹膜，钝性游离出一侧卵巢，沿卵巢基底部钳夹骨盆漏斗韧带血管、系膜及卵巢固有韧带，完整切除卵巢，交叉贯穿缝合残端，同样的方式切除另一侧卵巢。检查有无活动出血，无出血，连续缝合创面，关闭腹腔。假手术组不切除卵巢，以卵巢周围部分脂肪替代，其他操作相同。所有动物术后连续3 d给予一定量的镇痛剂痛立定，每日一次。所有动物手术结束后给予一定量的抗生素。麻醉恢复期动物允许自由的活动及完全负重，动物实验人员在麻醉恢复期须密切监控所有动物。

手术后第2天开始给药治疗，AN04-2低、中、高剂量组分别给予0.06、0.6、6 m/kg的AN04-2，假手术组与模型对照组给予生理盐水，给药体积为1 mL/kg，给药方式为每周1次皮下注射；阳性对照组给予市售的特立帕肽注射液(PTH，Lily)，剂量为10 μg/kg，给药方式为每日1次皮下注射。

分别于实验开始前、实验中每周1次，及实验结束时测量记录称重。治疗12周后，处死动物，取材腰椎L5及右股骨，采用DXA骨密度仪(Hologic Discovery Wi，USA；Hologic APEX 3.1.2软件)检测松质骨面积骨密度(BMD)。

1.6 安全性初步评价

180～220 g的SD大鼠30只，按体重随机分为3组，每组10只，雌雄各半，分别为溶媒对照组、AN04-2低、高剂量组。AN04-2低、高剂量组分别给予50、100 mg/kg的AN04-2，给药方式为静脉单次注射，给药体积为5 mL/kg，溶媒对照组给予相同体积的生理盐水。给药后持续观察动物的反应情况，给药后第1、3、5、7、14天分别称重1次，连续观察14 d，记录一般状态及体重等[19]。

给药后立即观察动物的反应情况，并持续观察12 h，观察内容包括动物体重、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物等变化，记录动物的死亡情况、中毒症状及中毒反应的起始时间、严重程度、持续时间等。

给药后第 14 天，麻醉动物并安乐死，进行大体解剖检查，肉眼观察各器官和组织的变化，并记录出现异常的组织和器官。

1.7 统计学处理

利用GraphPad Prism (GraphPad Software,Inc.) 进行数据分析。采用单因素方差分析法分析组间平均值。若差异较大，则采用Dunnett’s校验法进一步分析。当P<0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AN04-2体外对人成骨细胞的作用

与模型对照组(生理盐水)相比，0.3～10 μmol/L浓度的AN04-2可显著促进人成骨细胞HFOB1.1的ALP的表达(P<0.01)，且量效关系明显(图1)，提示AN04-2具有促进成骨的作用。

图1 AN04-2对人成骨细胞ALP表达的影响Fig.1 Effect of AN04-2 on ALP expression in human osteoblasts

图2 AN04-2对斑马鱼骨质疏松模型的治疗作用(拍照)Fig.2 Therapeutic effect of AN04-2 on zebrafish osteoporosis model

2.2 AN04-2对斑马鱼骨质疏松模型的治疗作用

泼尼松龙诱导，建立斑马鱼骨质疏松模型。与正常对照相比，模型对照组斑马鱼脊椎骨荧光强度显著下降(P<0.001)，表明模型构建成功。与模型对照组相比，阳性对照组斑马鱼脊椎骨荧光强度显著升高(P<0.001)，表明试验系统成立，可用于评价药物对骨质疏松的治疗作用。

与模型对照组相比，剂量为15、50 ng/尾的AN04-2治疗，斑马鱼脊椎骨荧光强度显著升高(P<0.001)，骨密度分别比模型对照组增加74.58 %和62.88 %，剂量为5 ng/尾的AN04-2治疗，斑马鱼脊椎骨荧光强度则没有明显的升高(P>0.05)(表1、图3)，提示AN04-2对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松具有剂量依赖的治疗作用。

表1 AN04-2对斑马鱼骨质疏松模型的治疗作用Table 1 Therapeutic effect of AN04-2 on zebrafish osteoporosis

2.3 AN04-2对大鼠骨质疏松模型的治疗作用

治疗12周后，与假手术组相比，模型对照组第五腰椎(L5)和右股骨的BMD明显降低(P<0.01)，显示模型构建成功。与模型对照组相比，阳性对照组(PTH治疗)第五腰椎和右股骨的BMD明显升高(P<0.01)，提示试验系统成立，可以用于评价药物对骨质疏松的治疗作用。

与模型对照组相比，1周1次皮下注射不同剂量的AN04-2，治疗组第五腰椎和右股骨的BMD有升高的趋势(表2)，但差异并没有统计学意义(P>0.05)，显示1周1次皮下注射AN04-2对于骨质疏松虽有一定的治疗作用，但治疗作用较弱，与每日1次皮下注射的市售阳性药物(PTH)相比，并没有明显的治疗优势，可能提示AN04-2的半衰期不能支持1周1次的给药周期。

表2 AN04-2对大鼠骨质疏松模型的治疗作用Table 2 Therapeutic effect of AN04-2 on rat osteoporosis

2.4 安全性初步评价

给药治疗期间，各组大鼠均活动正常、毛发光滑，体重呈正常增长，未见明显异常反应，各组动物均无死亡。体重变化如表4所示。

表3 各组体重变化及死亡情况Table 3 Weight change and death in each treatment

AN04-2处理14 d后，处死各组大鼠，进行大体剖检。各组大鼠脏器形态、重量均正常，未见明显异常。

SD大鼠静脉注射给予AN04-2高至100 mg/kg，未见明显不良反应。静脉注射的最大耐受剂量(MTD)为100 mg/kg。

3 讨论

AN04-2是新型的拟用于治疗骨质疏松的融合蛋白药物，本文对其治疗骨质疏松的成药性进行评价，以推动其尽快进入临床前开发。

众所周知，骨质疏松目前的治疗药物很多，但绝大多数为骨吸收抑制剂(如雌激素受体调节剂、双膦酸盐、RANKL抑制剂、降钙素等)，而骨形成促进剂(如甲状旁腺素类似物、阿巴帕肽等)的种类却非常少。在体内外试验中，AN04-2可以显著的促进成骨细胞ALP的表达，显著提高斑马鱼脊椎骨的骨密度，属于新型的骨形成促进剂，这是该药物独特的作用特点。

AN04-2对大鼠骨质疏松模型的治疗作用则较弱，药效不及市售药物PTH。但需要注意的是，AN04-2为每周注射1次，而PTH为每日注射，AN04-2的给药频率远远低于PTH，这可能影响了AN04-2的药效作用。后续有必要考察AN04-2每周2次或者每日1次与PTH的药效比较。

AN04-2的安全性非常好，大鼠静脉注射高至100 mg/kg，无任何毒性反应。良好的安全性，有利于保证其临床应用。

综上所述，AN04-2可显著提高骨质疏松模型的骨密度，同时安全性好，具有较好的成药性，后续优化其给药周期，则有希望开发为治疗骨质疏松的新型药物。