花生分子育种研究进展

蔺儒侠 郭凤丹 王兴军 夏 晗 侯 蕾

（1山东师范大学生命科学学院，250014，山东济南；2山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室，250100，山东济南）

花生是世界范围内重要的油料作物和经济作物。近年来，花生全基因组测序的完成促进了分子标记的开发利用和关键农艺性状连锁QTL的鉴定，加速了转基因技术改良花生品种的进程，标志着分子育种已经成为花生新品种培育的重要技术手段之一。本文概述了近年来花生分子育种的研究进展，并对现代分子生物学和生物技术在花生育种方面存在的主要问题和应用前景进行了讨论。

1 花生分子标记的开发

分子标记是分子辅助选择和设计育种的基础，近年来花生中大量的分子标记被开发出来，为花生分子育种提供了便利条件。Zhao等[1]以二倍体野生种花生基因组为参考序列，分别从A和B基因组中鉴定出135 529和199 957个SSR位点，并分别构建了花生A和B基因组的物理图谱。Zhong等[2]对花生果针不同发育时期的转录组数据进行分析，挖掘出5058个SSR标记，利用其中的200个SSR标记对22个花生品种进行多态性分析，筛选出17个具有多态性的SSR标记。徐志军等[3]根据花生栽培种RNA-Seq数据，鉴定出19 143个SSR位点，其中13 477个SSR位点可用于分子标记开发。

在高通量和低成本测序技术的推动下，包括测序基因分型（genotyping-by-sequencing，GBS）、限制性位点关联的 DNA测序技术（restriction-site associated DNA，ddRAD-seq）和特异位点扩增片段测序（specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq）等简化基因组测序技术也逐渐应用到花生分子标记的开发中。有研究[4]对169份花生核心种质进行GBS分析，从全基因组水平开发InDel标记，获得了10 401个InDel标记，并对其进行功能分类和注释，为进一步种质遗传资源研究和分子遗传改良奠定基础。Zhou等[5]以花生品种中花 5号和ICGV86699为亲本构建重组自交系（recombinant inbred line，RIL）群体，通过分析ddRAD-seq所得的序列，在亲本中开发出53 257个SNP标记，从群体中开发出14 663个SNP标记。

2 花生遗传连锁图谱的构建

花生不同类型分子标记的大量开发，促进了高密度花生遗传连锁图谱的构建。Halward等[6]利用野生种群体构建了第1张花生属遗传图谱，该图谱含有117个RFLP标记和11个连锁群，总长度1063cM。Creste等[7]通过二倍体野生种种间杂交和再回交法组建群体，构建了含有167个RAPD标记和39个RFLP标记的遗传图谱。Milla等[8]也利用二倍体野生种杂交后代群体构建了一张含有78个AFLP标记的遗传连锁图谱。另外，近年栽培种花生的遗传连锁图谱构建也取得了很大进展。Varshney等[9]利用RIL群体构建了首张基于SSR标记的栽培种花生遗传图谱，Ravi等[10]在该图谱基础上又增加了56个位点，构建了包含191个SSR标记的遗传图谱，涵盖22个连锁群，全长1785.4cM，标记间平均距离9.3cM。Hong等[11]对栽培花生的3个RIL群体进行遗传图谱构建，检测到175个多态性SSR位点，涵盖22个连锁群，全长885.4cM。Zhou等[5]基于SNP测序构建花生栽培种遗传图谱，包括1621个SNP标记和64个SSR标记，涵盖20个连锁群，全长1446.7cM。Khan等[12]构建了具有1975个SNP位点和5022个SNP位点的2个高密度遗传连锁图谱。Agarwal等[13]也开发了基于SNP标记的高密度遗传图谱，包括8869个SNP标记，涵盖20个连锁群，全长3120cM。

3 重要性状的分子标记与QTL定位

鉴定重要性状连锁的分子标记是标记开发的关键环节。目前开发的花生重要性状的分子标记大多与抗病相关。夏友霖等[14]以AFLP分析结合BSA方法筛选到与晚斑病抗性连锁较紧密的3个AFLP标记，与抗性间的遗传距离分别为 7.40、7.40和8.67cM。Shoba等[15]和 Sukruth等[16]分别鉴定出 1个和3个与晚斑病抗性显著相关的SSR标记。雷永等[17]采用AFLP技术和BSA分析方法，获得了与花生黄曲霉菌侵染抗性连锁的2个分子标记，与抗性间的遗传距离分别为 8.8和 6.6cM。任小平等[18]采用AFLP技术和BSA分析方法，获得2个与花生青枯病抗性基因连锁的分子标记，与抗性间的遗传距离分别为8.12和11.46cM。Herselman等[19]和肖洋等[20]采用BSA法获得与花生矮化病毒病抗性基因连锁的AFLP和SSR分子标记。黄莉等[21]通过筛选远杂9102和中花5号杂交后代衍生的RIL群体，获得了2个与花生含油量相关的SSR标记，其中标记2A5-250与低油特性的相关性为95.0%，标记2A5-240与高油特性的相关性为88.9%。有关花生关键性状连锁标记的开发仍然较少，在一定程度上限制了育种工作中分子标记辅助选择的利用。

花生重要性状关联的 QTL和候选基因的定位为花生分子育种提供了有力的支撑。在抗病方面，Wang等[22]利用高抗青枯病品种远杂9102构建RIL群体，在B02染色体定位了4个与抗青枯病相关的QTL，其中QTL主效区域包含21个NBS-LRR基因。同样，Luo等[23]基于测序QTL定位方法（QTL-seq），在B02染色体上定位了1个与青枯病相关的QTL，区间大小为 2.07Mb。在抗叶斑病方面，Agarwal等[13]利用Tifrunner和GT-C20构建的RIL群体，定位了7个与早斑病抗性关联的QTL、3个与晚斑病关联的QTL和9个与番茄斑萎病关联的QTL。Shirasawa等[24]利用感病品系 Tag24和抗病品系GPBD4建立RIL群体，分别将晚斑病和锈病关联的候选QTL定位于A02和A03染色体1.4和2.7Mb基因组区间内。Agarwal等[25]利用SunOleic 97R和NC94022构建RIL群体，定位了3个与番茄斑萎病抗性相关的QTL，其中对表型变异贡献率最大的QTL位于89.5kb的物理距离范围内，利用该 QTL连锁的竞争性等位基因特异性 PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）标记能实现群体内抗病和感病个体的快速分离。

在产量和品质性状方面，Wang等[26]利用 195份花生材料挖掘出13 435个高质量的SNP位点，通过GWAS分析发现93个SNP与4个产量性状连锁。Zhang等[27]采用花育36号和种质系6-3的RIL群体，鉴定出与百粒重、种子长度和种子宽度等性状相关的27个QTL。Pandey等[28]利用SunOleic 97R×NC94022和 Tifrunner×GT-C20的RIL 群体，分别鉴定出6个和9个与控制含油量关联的QTL。Liu等[29]以徐花13和中花6号的RIL为材料，检测到7个控制含油量的QTL，将位于A08染色体上的主效QTL qOCA08.1定位在0.8Mb的物理区间内，并发现了2个调控油脂合成的基因。

株型和脱壳率等重要农艺性状与花生的产量、抗病性和机械化收获息息相关。Li等[30]以直立型花生品种冀花5号和匍匐型品种M130的杂交群体为材料，通过SLAF-seq技术检测到39个与生长习性相关的QTL，其中有12个QTL在B05号染色体上0.17Mb的区间内，该区间多数基因与光和激素信号相关。Luo等[31]利用QTL-seq方法在远杂9102和徐州68-4杂交的RIL群体中发现2个与调控脱壳率相关的QTL，分别位于A09（2.75Mb）和B02（1.1Mb）染色体上，在这2个区段上包含9个与脱壳率相关的候选基因。

4 利用分子标记辅助选择培育高油酸花生

分子标记辅助育种与传统遗传育种相结合能够加速育种的进程。高油酸花生品质稳定，营养价值高，国内多家单位开展花生高油酸分子标记辅助育种，是迄今为止花生分子标记辅助选择技术应用到育种中最成功的例子。花生高油酸性状主要由2个主效基因FAD2A和FAD2B控制，针对这2个主效基因突变位点已经开发的检测方法包括CAPS标记、KASP标记、等位基因特异PCR和PCR产物测序等[32-34]。赵术珍等[35]以花育23号和花育31号为母本，以高油酸花生品种Sunoleic95R、DF12和开农176为父本，利用优化的CAPS标记和PCR产物测序法以及FAD2基因KASP检测方法，对自交和回交后代进行检测，获得一批高油酸花生材料。Bera等[36]利用分子标记辅助回交技术，将高油酸种质SunOleic95R的2个FAD2突变等位基因导入高油酸花生育种系ICGV06100，轮回亲本油酸含量提高 97%，亚油酸含量降低 92%，油酸/亚油酸（O/L）比值增加到 25。潘雷雷等[37]以鲁花 11号为母本、开农1715为父本，利用PCR产物测序法和系谱法筛选出油酸含量 80.40%、亚油酸含量2.50%、O/L比值 32.16的高油酸花生新品种宇花91。以大面积推广的4个不同类型花生品种为轮回亲本，利用FAD2标记辅助回交选择，定向获得了24个稳定的高油酸改良材料[38-39]。Chu等[40]利用CAPS标记辅助选择技术对线虫抗性品种 Tifguard油酸含量进行改良，育成油酸含量高的抗线虫新材料。

5 花生转基因研究

近年来，利用基因工程将外源基因导入花生，获得了一些优质的花生转基因品系，为花生育种和种质创新提供了另一个选择。目前，用于花生基因转化的主要有油脂合成相关基因、过敏原基因和抗性基因等。

5.1 油脂合成相关基因的转化

花生作为重要的油料作物，其脂肪酸含量和种类一直是受关注的问题。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在脂肪酸合成过程中起着非常关键的作用。将AhPEPC基因反义表达载体转入花生，通过抑制花生中AhPEPC基因的表达，可提高转基因种子含油量 5.7%～10.3%[41]。AtLEC1参与调节种子或其他器官中贮藏脂类的生物合成与积累。Tang等[42]利用种胚特异启动子将AtLEC1基因转入花生，转基因花生种子含油量提高4.42%～15.89%，硬脂酸、油酸和亚油酸等脂肪酸含量在不同品系间也发生了显著变化。利用种子特异启动子Lectin和组成型启动子CaMV35S构建AhFAD2基因的RNAi干扰载体，分别转化丰花1号和花育23号获得转基因花生纯合体株系，各转基因株系中AhFAD2基因的转录水平普遍下调，后代株系种子的油酸含量显著提高，丰花1号和花育23号的转基因后代分别提高15.09%和36.40%[43]。与组成型启动子CaMV35S相比，Lectin启动子对AhFAD2基因表达的抑制效果更明显。

5.2 过敏原基因的转化

花生是重要的食物过敏原之一，在人体内会引起lgE介导的超敏反应，严重时会导致死亡。通过构建花生过敏原基因Arah2的敲除载体，转化花生，使转基因花生种子中Arah2基因表达量显著降低，且未检测到Arah2蛋白积累[44]。利用基因枪法用Arah2的RNAi载体转化花生，在3个转基因株系中Arah2的表达均受到显著抑制，其中2个株系中Arah6的表达也显著降低[45]。

5.3 抗性基因的转化

在花生抗逆性方面，以抗虫、抗病、抗旱和抗除草剂基因方面研究较多。将烟草条纹病毒的外壳蛋白基因转入花生，对转基因纯合株系进行接种试验，结果表明转基因植株对病毒侵染抗性明显增强[46]。将豇豆胰蛋白抑制剂基因CtPI转入花生，在成熟胚中定向表达，明显提高了转基因花生对棉铃虫的抗性[47]。通过转化水稻几丁质酶基因，明显提高了转基因花生叶片中几丁质酶活性，比对照花生叶片高2～14倍，使转基因花生叶片获得对晚斑病、锈病和黄曲霉的抗性[48]。在抗旱基因方面，脱水响应元件转录因子 DREB是一类可以激活多个干旱响应基因表达的转录因子，可提高作物抗旱性。王旭达等[49]将耐盐作物獐毛中的AlDREB2A基因导入花生中，提高了花生叶片相对含水量和脯氨酸含量，增强了植株的耐旱性。异戊烯基转移酶（IPT）是细胞分裂素生物合成途径中的关键酶。Qin等[50]用胁迫诱导启动子驱动的异戊烯基转移酶基因转化花生，转基因花生的耐旱性显著提高。为了培育抗除草剂品种，Chu等[51]将Bcl-xL基因转入花生后，检测出1个T1代继续表达中等水平BclxL的品系，经5μmol/L百草枯处理后的叶绿素水平明显高于对照，表现出对百草枯的耐受性。

6 问题与展望

花生全基因组测序、分子标记开发、图谱构建、QTL定位及转基因工程等领域的发展为花生分子育种奠定了坚实的基础。但与玉米、水稻等主要模式作物相比，花生分子育种研究明显落后，许多问题亟待进一步研究和解决。

6.1 加强与花生关键农艺性状连锁标记的开发

与花生抗性、产量和品质等重要农艺性状连锁的标记数量少，大大限制了分子标记辅助选择在育种中的应用。鉴定评价优异种质资源和突变体材料，解析更多关键农艺性状形成的分子机理，挖掘有用的基因和QTL，开发连锁的分子标记，是促进花生分子育种的重要支撑。

6.2 提高花生转基因效率

转基因效率低会影响基因工程改良，限制花生育种工作的发展。提高花生转基因效率是促进基因工程种质创新、研究基因功能的基础。

6.3 加大开发功能性分子标记

随着全基因组测序的完成，花生基因组学和功能基因组学研究将不断深入，利用高通量测序和 SNP芯片技术对不同种质资源进行全面评价和解析，发掘更多有利用价值的基因和QTL，以及功能性分子标记，进而促进花生分子育种技术的发展和完善，分子育种将在花生精准改良中发挥更大的作用。