基于网络药理学研究黄芪桂枝五物汤治疗类风湿关节炎的作用机制

蔡鑫 唐芳 马武开 兰维娅 蒋总 樊梅 金泽旭

【摘 要】目的：通过网络药理学方法探讨黄芪桂枝五物汤治疗类风湿关节炎的分子作用机制。方法：利用TCMSP数据库检索、筛选出黄芪桂枝五物汤中药活性成分和作用靶点，使用GeneCards预测类风湿关节炎疾病靶点，构建中药活性成分-靶点网络图，将获得的靶点导入STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络，对靶点基因进行GO和KEGG富集分析。结果：共筛选出黄芪桂枝五物汤中药活性成分74种，作用于217个靶点，类风湿关节炎疾病靶点4329个，从而获得药物和疾病的共同靶点146个。GO分析涉及对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、脂筏、膜微区、核受体活性，及类固醇激素受体活性等方面。KEGG主要富集在PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路，及白细胞介素-17信号通路等。结论：黄芪桂枝五物汤通过多成分、多靶点及多途径的方式治疗类风湿关节炎。

【关键词】 关节炎，类风湿;黄芪桂枝五物汤;网络药理学;信号通路;作用机制

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性进行性自身免疫性疾病，临床主要表现为关节滑膜炎症及关节外病变，由于其具有较高的致残率，给社会和患者家庭带来严重影响[1]。RA发病率为0.5%～1%，在不同人群中存在差异，男性发病率低于女性[2]。目前，RA主要治疗方式为免疫抑制剂、激素、非甾体抗炎药和分子靶向治疗等，但存在不良反应多、价格昂贵等不足[3]。RA属中医学“痹证”范畴，运用中医药治疗痹证具有悠久的历史，临床疗效确切且不良反应小，有助于改善RA患者相关临床症状和提升生活质量[4]。黄芪桂枝五物汤首载于《金匮要略·血痹虚劳脉证并治篇》，由黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣组成，是治疗痹证的常用方剂[5]。临床应用黄芪桂枝五物汤治疗RA疗效较好，但缺乏对相关作用机制的研究，不能从细胞和分子层面系统揭示其治疗RA的分子途径[6-8]。

网络药理学具有综合性研究特点，将网络生物学、药理学及生物信息学等多学科相互联系，能够较为系统地阐述中药活性成分和作用机制，体现中药组方多成分-多靶点的作用关系，与中医学整体观念及辨证论治理论体系有着高度相似性[9]。因此，本研究应用网络药理学研究方法，探讨黄芪桂枝五物汤治疗RA的物质基础和潜在的作用机制，为今后实验研究提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 黄芪桂枝五物汤活性成分及靶点筛选 借助TCMSP数据库（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）搜集黄芪桂枝五物汤中黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣的活性成分，同时以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选，获得符合条件的中药活性成分和相应靶点，并使用UniProt在线数据库（https：//www.uniprot.org/）对靶点进行标准化处理。

1.2 RA相关靶点预测 以“rheumatoid arthritis”为检索关键词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中收集RA的相关靶点。

1.3 构建“中药活性成分-作用靶点”网络关系图 将中药活性成分的作用靶点与疾病相关靶点取交集，获得交集靶点即为黄芪桂枝五物汤治疗RA的潜在靶点。构建药物活性成分-作用靶点网络图，使用软件Cytoscape 3.7.1中的“Network Analyzer”程序对该网络图进行分析，节点（Node）表示黄芪桂枝五物汤所含有的药物活性成分和潜在治疗靶点，边（Edge）代表活性成分和相应作用靶点的联系。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建与关键靶点筛选 将药物活性成分-疾病的共同靶点导入STRING平台（https：//string-db.org/）进行PPI分析，选择研究对象物种为“人”（Homo sapiens），获得黄芪桂枝五物汤作用于RA的PPI网络关系图。利用Cytoscape 3.7.1软件的“Network Analyzer”程序對网络进行可视化分析，根据度值（Degree）和介数中心性（Betweenness Centrality）筛选出关键作用靶点。

1.5 基因本体功能（GO）与京都基因与基因组百科全书通路（KEGG）富集分析 将药物活性成分-疾病的共同靶点导入DAVID数据分析平台，将阈值设定为P < 0.05，选择物种为“Homo sapiens”，并将靶点基因标准化为官方名称（official gene symbol），进行GO和KEGG富集分析。

2 结 果

2.1 黄芪桂枝五物汤活性成分筛选 使用TCMSP数据库分别对黄芪桂枝五物汤中5味中药的活性成分进行收集，设定过滤条件为OB≥30%，DL≥0.18。共获得74个活性成分，其中黄芪20个、桂枝7个、白芍13个、生姜5个、大枣29个，根据OB值进行排序，列出OB值前20的中药活性成分。见表1。

2.2 黄芪桂枝五物汤治疗RA相关靶点的筛选 在TCMSP数据库中预测获得药物活性成分靶点217个，从GeneCards数据库获得RA疾病靶点4329个。将药物活性成分靶点与疾病靶点绘制韦恩图取交集，得到146个相同靶点，即为黄芪桂枝五物汤治疗RA的潜在靶点。见图1。

2.3 药物活性成分-靶点网络构建 利用软件Cytoscape3.7.1构建中药活性成分-靶基因相互作用关系网络，包括179个节点（黄芪桂枝五物汤活性成分节点33个，靶基因节点146个）和247条边。主要活性成分有芒柄花黄素（formononetin）、异鼠李素（isorhamnetin）、毛蕊异黄酮（calycosin）、花旗松素（taxifolin）、小檗碱（berberine）、香豆雌酚（coumestrol）、儿茶素（catechin）、芍药苷（paeoniflorin）等，这些可能是黄芪桂枝五物汤治疗RA的关键活性成分。见图2。

2.4 PPI网络构建及关键靶点基因筛选 为进一步探讨黄芪桂枝五物汤治疗RA的分子机制，利用STRING数据库对146个药物和疾病的共同靶基因进行PPI分析，利用Cytoscape 3.7.1软件中“Network Analyzer”程序将所得结果进行可视化分析。PPI网络中共144个靶点基因相互作用（有2个靶基因未参与蛋白互作），2659条边表示各靶点蛋白间相互作用关系。根据Degree和Betweenness Centrality进行排序，Degree越大说明该靶基因与其他蛋白相互作用频次更多（图中节点大小代表Degree值的大小），Betweenness Centrality越高则该靶点基因越重要。筛选出的关键基因主要包括AKT1、白细胞介素（IL）-6、白蛋白（ALB）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、JUN、表皮生长因子（EGF）、基质金属蛋白酶（MMPs）-9、表皮生长因子受体（EGFR）、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、MMP-2、IL-1β等，这些靶点基因可能是黄芪桂枝五物汤治疗RA的关键靶点。见图3。

2.5 GO和KEGG富集分析结果 将146个药物活性成分-疾病交集靶点基因导入DAVID数据平台进行GO和KEGG富集分析。GO分析结果显示，生物过程（BP）主要涉及对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、对金属离子的响应（response to metal ion）、对抗生素的反应（response to antibiotic）、对活性氧的反应（response to reactive oxygen species）、细胞对氧化应激的反应（cellular response to oxidative stress），及对氧含量的反应（response to oxygen levels）等;细胞组分（CC）主要与脂筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、突触前膜的组成成分（integral component of presynaptic membrane），及转录因子复合物（transcription factor complex）等相关;分子功能（MF）主要包括核受体活性（nuclear receptor activity）、类固醇激素受体（steroid hormone receptor activity）、儿茶酚胺结合（catecholamine binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding），及RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合（RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding）。见图4。KEGG通路富集分析主要包含PI3K-Akt信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、IL-17信号通路，及Toll样受体信号通路等。见图5。

3 讨 论

中药复方或单味中药是具有多成分、多靶点以及多层次特点的复杂体系，借助网络药理学方法有助于对其进一步探索。陈慧等[10]应用网络药理学研究发现，四妙丸可能通过调节TNF信号通路治疗RA。GUO等[11]对乌头汤治疗RA的可能机制进行了网络药理学探讨。本研究筛选获得黄芪桂枝五物汤治疗RA的潜在药物活性成分主要包括芒柄花黄素、异鼠李素、毛蕊异黄酮、花旗松素、小檗碱、香豆雌酚、儿茶素、芍药苷等。芒柄花黄素具有增强免疫应答功能的作用[12]，能抑制VEGF和MMPs的表达[13]，而RA滑膜过度生长所释放的MMPs是引起骨质破坏的重要因素。异鼠李素能够有效抑制肾癌模型小鼠肿瘤细胞生长[14]，使用脂多糖（LPS）刺激人白血病单核细胞株（THP-1）诱导其释放TNF-α、IL-6等炎症因子，经异鼠李素干预后炎症因子表达明显受抑制，并且呈浓度依赖性，表明具有一定的抗炎作用[15]。辛敏等[16]使用不同浓度毛蕊異黄酮干预膀胱癌T24、T739细胞，发现其通过拮抗PI3K-Akt信号通路，增加促凋亡基因B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）表达而诱导癌细胞凋亡。花旗松素能显著抑制体外培养的人肺癌细胞A549增殖，可能与下调Bcl-2蛋白表达相关[17]。MMP-2和MMP-9与肿瘤侵袭及转移能力关系密切。小檗碱能够下调膀胱癌细胞MMP-2、MMP-9蛋白的表达，降低肿瘤侵袭能力，相关机制可能是抑制了PI3K-Akt信号通路传导[18]。在对乳腺癌MDA-MB-231细胞的研究中，发现小檗碱可通过诱导细胞凋亡和自噬发挥抗肿瘤功效[19]。香豆雌酚对体外培养的膝骨关节炎患者软骨细胞具有保护作用，有效降低了MMP-1和MMP-3的表达，减少软骨基质降解[20]，具有抗分解和抗氧化作用，能抑制骨关节炎模型大鼠软骨细胞中IL-1β的表达[21]。儿茶素能够有效抑制胃癌细胞的迁徙和迁移[22]。芍药苷可显著抑制RA动物模型大鼠滑膜成纤维细胞（FLS）增殖，延缓大鼠病理进展[23]。将芍药苷灌胃干预LPS诱导的急性脑损伤小鼠模型，发现HO-1蛋白水平上调，可能通过清除氧自由基、增加抗氧化能力发挥作用[24]。

黄芪桂枝五物汤治疗RA的潜在靶点共146个，经过PPI分析筛选获得关键靶点基因主要有AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、MMP-9、PTGS2等。AKT1作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K-Akt信号通路的重要调节因子，能够抑制肿瘤细胞凋亡，在恶性肿瘤病程转归中具有重要意义，通过磷酸化Caspase-9前体产生抗凋亡效应[25]。IL-6与RA患者疾病活动程度有密切联系，能够促进FLS中MMP-1、MMP-9等的表达，是导致RA骨质破坏的主要炎性因子[26]。RA主要病理改变表现为血管翳形成，VEGFA是这一病理过程的重要促进因素，VEGF通过参与炎症反应和提升血管新生能力，不但加速动脉粥样硬化，同时亦是RA患者合并心血管相关疾病的重要原因[27]。PTGS2参与滑膜炎症反应过程，与免疫反应、凋亡过程等相关，可调节成骨细胞与破骨细胞增殖及分化[28]。

GO富集分析显示，黄芪桂枝五物汤治疗RA主要与对脂多糖的反应、对活性氧的反应、细胞对氧化应激的反应、转录因子复合物、核受体活性，及类固醇激素受体等相关。脂多糖能够刺激体内免疫细胞，诱导其分泌炎性细胞因子，促使RA-FLS增殖和MMP-9表达上调，导致RA关节软骨受损[29]。氧化应激反应会引起炎性细胞因子浸润，增加活性氧以及活性氧簇自由基表达，进一步破坏透明质酸，降解关节软骨[30]。KEGG富集结果显示，主要涉及PI3K-Akt信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、IL-17信号通路，及Toll样受体信号通路等。PI3K-Akt信号通路在滑膜组织中广泛表达，在促进RA-FLS增殖、分化，抑制其凋亡的生物学过程中起关键作用。但该信号通路激活时能够上调Bcl-2和下调Bax水平，进一步加重了RA发展[31]。本研究筛选获得的关键活性化合物如芒柄花黄素、毛蕊异黄酮及小檗碱等，均能够通过调节PI3K-Akt通路发挥抗肿瘤细胞增殖和促凋亡效应。TNF信号通路及IL-17信号通路介导RA炎症反应，增加RA-FLS致炎因子表达[32]。Toll样蛋白是免疫系统重要组成要素，研究发现，其在病情活动期RA患者的外周血单核细胞中明显增加，与炎症因子相关[33]。综上所述，黄芪桂枝五物汤可能通过调节多条信号通路，影响细胞增殖与凋亡、炎症反应和氧化应激损伤等病理过程，发挥治疗RA的作用。

本研究应用网络药理学方法探讨了黄芪桂枝五物汤治疗RA的潜在物质基础和分子作用机制，结果显示，黄芪桂枝五物汤具有多种活性成分，通过多靶点、多途径的作用方式治疗RA，初步阐述了相关的分子途径，为今后的研究提供了部分理论支持。所筛选出的活性成分涉及抗炎、抑制肿瘤细胞增殖及促进其凋亡等，其中可能主要通过调节PI3K-Akt信号通路发挥治疗RA的作用。RA的发生、发展与自身免疫系统失衡密切相关，本研究发现，黄芪桂枝五物汤活性成分虽与调节免疫方面关联较少，但大部分活性成分均可通过调节PI3K-Akt信号通路来抑制肿瘤细胞增殖与促进凋亡，而该通路在RA中扮演重要角色，因此黄芪桂枝五物汤对于控制RA滑膜细胞类肿瘤样增殖取得积极作用。但由于网络药理学的预测具有一定局限性，研究所得相关活性成分、靶点基因及信号通路等需要后期的实验予以验证。

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收稿日期：2020-09-25;修回日期：2020-10-18