代谢组学在骨质疏松中的研究进展△

刘 云，罗晓婷，李 崇，廖世杰，林成森，李波香，冯文宇，谢天裕*

（广西医科大学第一附属医院a.骨科；b.药学部，广西南宁 530021）

骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征的代谢性骨病［1］，可导致骨骼强度的降低以及骨折风险的增加［2］。代谢组学，即在细胞、组织或整个生物体中对小分子代谢物的综合分析［5］，而代谢物是细胞功能的组成部分并参与酶催化反应，上游的生物干扰可导致一系列的代谢组学改变，因此，代谢组学拥有丰富的信息并被认为是最有预测能力的表型［6］。故代谢组学作为一种特定生物系统表型的化学反映，现在经常被用于了解疾病进展中的病理生理过程，以及寻找各种生物体疾病新的诊断或预后的生物标志物［7］。过去的十年里代谢组学的研究已成为研究热点［8］。利用代谢组学技术对OP患者进行早发现、早诊断、早治疗及预防骨折发生不但有利于降低患病率，提高患者的生活质量，而且有利于减轻患者家庭及社会的经济负担。

1 代谢组学的概述

代谢组学是对生物样品在代谢过程中产生的小分子（即代谢物）定量，收集能反映体内环境变化及疾病状态的丰富信息并进行分析，从而进一步了解探索疾病［9］。代谢组学的基本步骤主要分为三步：样品制备、代谢物测定及数据分析。

1.1 样品的制备

由于许多重要的代谢物会在几秒钟内就会发生反应转换，因此，若要获得准确的代谢物几乎需要让细胞立即停止代谢活动，而经典的方法包括冷冻和或酶变性［8］。此外，在提取培养细胞的代谢物时，最好避免可能改变新陈代谢的操作，如在代谢骤冷之前进行制粒或洗涤细胞等［10］。而在提取组织标本的代谢物时，最好先冷冻再提取，快速冷冻可以在液氮下金属板之间粉碎组织来实现，且必须注意避免采样前和采样期间的代谢变化，因为麻醉等操作都会引起新陈代谢的变化［11,12］。根据研究报道，受试动物（或患者）即使只是看到实验者(或医生)也可能引起改变新陈代谢的应激反应［13］，从而导致体内代谢物的突变，最终影响组织标本代谢物的准确提取。

1.2 代谢物的测定

代谢组学中用于测定代谢物的方法大体上主要分为：核磁共振法（nuclear magnetic resonance,NMR）、质谱法（mass spectrometry,MS）及色谱法（chromatographic）。在代谢组学的早期，一维核磁共振通常被用来生成代谢组学谱，而其中的大多数反映了多种代谢物的综合信号，由于核磁共振在阐明结构和测量体内代谢物方面的能力较强，使其在如今的代谢组学中仍发挥重要作用［8,14-17］。质谱具有发现和表征新型生物标志物的潜力，在检测低浓度代谢物且不受亲缘关系较近的物种干扰方面具有无与伦比的能力，加上现代质谱仪卓越的分辨能力和灵敏度，使得质谱在代谢组学研究中发挥重要作用［8,18］。然而，在进行质谱分析时需要将代谢物电离，而电离过程中离子间存在竞争性，且高电离能量可以将某些代谢物分解成与其他代谢物相同的片段，所以直接进行质谱分析会存在许多错漏，而通过在质谱测量前在色谱柱上对分析物进行物理分离，可降低离子间的竞争，且色谱法的另一个优点是使同分异构体分离，色谱的加入提高了对低浓度代谢物的检测，也提高了质谱的定量准确性及代谢组学的覆盖率［8,19-22］。根据研究报道，色谱种类较多，比如：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）、超高效液相色谱法 （ultra high performance liquid chromatography,UHPLC）、超高压液相色谱法（ultra-high-pressure liquid chromatography,UHPLC）、反相液相色谱法（reversed phase liquid chromatography,RPLC）、亲水作用液相色谱法（hydrophilic interaction liquid chromatography,HILC）等，而质谱与色谱通常又是联用的，如气相色谱-质谱（GC-MS）及液相色谱-质谱（LC-MS） 等［8,23,24］。

1.3 数据分析

数据分析的第一步是数据的处理：将原始的质谱数据制作成带注释的表格，以便描述样本的峰值意义和强度；接下来解释数据中强度和浓度之间的关系，同时还需发现代谢物在不同条件下发生的显著变化；然而，在不同的化合物中，反应的影响因素(如电离效率等)有很大的不同，因此，代谢物绝对定量需要与标准定量进行比较，且由于许多代谢物没有同位素标准而使其更容易被贴上标签，所以最好的方法是在淬火时加入同位素标准以便追踪［8,25,26］。

2 代谢组学在骨质疏松发病机制研究中的应用

OP的发病机制从大体上可以理解为骨吸收和骨形成之间的平衡由于某些病因被破坏后，使得骨吸收量超过骨形成量导致骨组织微结构被破坏而导致骨脆性增加且易发生骨折。根据目前的研究进展，OP的发病与机体代谢的变化有很大关系，而应用代谢组学技术研究其具体发病机制也已成为热点。

根据对去卵巢大鼠OP模型的研究发现，改变的代谢物主要涉及能量、脂质及氨基酸等的代谢［27］，利用代谢组学和电子显微镜检测到与3个月大的小鼠相比，13个月大的小鼠代谢物中的6-碳和3-碳糖的糖酵解中间体数量均显著增加，然而线粒体三羧酸循环中间体的数量没有显著变化，同样NAD+/NADH比值下降以及核苷酸代谢障碍，极可能表明线粒体功能受损导致糖酵解转移而出现能量代谢障碍，最后导致细胞死亡，所以氧化代谢在衰老的骨骼中受损最终导致骨质丢失进而发展成OP［28］。有研究发现，在将雌二醇应用于破骨细胞（RAW264.7）增殖及分化的抑制实验中，采用UHPLC-MS技术检测发现RAW264.7内27种代谢物的水平均发生改变，其中LPC的水平显著降低，同时降低的还有甲烷二羧基醛（MDA）、活性氧(ROS)、其他脂质和氨基酸衍生物等，而升高的主要为磷脂酰胆碱-甾醇酰基转移酶(phosphatidylcholine-sterolacyl transferase,LCAT)及超氧化物歧化酶（SOD）等［29］。其中，LPC可以上调黏附分子和多种编码生长因子和环氧合酶-2的基因的表达，通过这些基因调控可促进破骨细胞的增殖和分化,而LCAT是LPC代谢过程中的关键酶，在RAW264.7的增殖和分化抑制实验中均发现LCAT被雌二醇上调，LCAT的高表达可以分解LPC形成胆固醇酯而导致后者的表达显著降低，从而抑制了RAW264.7的增殖分化；此外有研究报道已证实氧化应激和抗氧化能力与骨质疏松症的发病机制有关，氧化应激可引起成骨细胞损伤和破骨细胞增殖，相反氧化应激的降低会导致破骨细胞损伤，由于MDA、ROS的降低和SOD的上升仅在RAW264.7的增殖抑制的实验中观察到，故氧化应激的降低可能只抑制了RAW264.7的增殖［29-31］。另有研究报道，通过脂质组学分析发现小鼠OP的发生与多种脂质代谢变化［比如OP模型组的溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholines，LPC）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）及游离脂肪酸的水平明显升高］有关，包括脂酰、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂和甾醇等，通常在一般情况下，机体可将氧化和抗氧化维持在动态平衡范围内，不会因活性氧过多而造成损伤，然而脂质代谢紊乱不但导致活性氧产生过多而增强了机体的氧化应激，从而超出机体的自我抗氧化防御能力使骨组织细胞受到破坏，还可抑制成骨细胞的增殖和分化，另外可通过RANKL的作用促进破骨细胞的增殖和分化，最后导致骨质流失造成 OP［32,33］。根据Ye等［34］的研究，去卵巢大鼠血清中的牛磺酸显著下降，而在Xue等［27］的研究中发现牛磺酸和谷氨酰胺的水平均下降明显，且二者的研究均证实氨基酸的代谢障碍与OP的发病密切相关。此外，已被证明与骨重建和骨骼发育呈正相关的牛磺酸是半胱氨酸的氧化产物，具有抗氧化活性，可以减轻动物和人类的氧化应激，且由于其可以与二价阳离子结合，这对骨重建和骨发育以及避免OP的发生至关重要［33,34］。而谷氨酸与半胱氨酸还有甘氨酸通过肽键形成谷胱甘肽［33］，后者是谷氨酰胺的代谢副产物，可作为一种氧自由基清除剂在维持细胞氧化还原状态方面发挥重要作用，可以保护正常器官组织免受氧化应激损伤［35-37］。由此可知，牛磺酸与谷氨酰胺发生代谢障碍后致使二者在机体中的水平下降，随后机体的抗氧化应激能力也因此下降，最后使得骨细胞被破坏而导致OP的发生。

所以，OP的发生发展与能量、脂肪、蛋白质及核苷酸等的代谢障碍密不可分，从代谢角度去认识代谢物变化与OP间的关系并探索关键的代谢物、信号通路及相关靶点等，可为明确其具体的发病机制、临床的预防及诊疗策略的制定等提供极大的帮助。

3 代谢组学在骨质疏松生物标志物研究中的应用

正常的骨转换涉及骨吸收和骨形成过程之间的平衡，在这一过程中破骨细胞通过酸化和蛋白水解消化去除（再吸收）骨，而成骨细胞分泌类骨质（骨的有机基质）进入再吸收腔［38］。如果由于某些病因使平衡被打破，就会使得破骨细胞相对活跃而导致OP，通过代谢组学技术检测在这一过程中血液及尿液中的某些标志性代谢产物的变化，将有可能对OP发病的预测及早期诊断提供帮助。

有研究发现，在对泼尼松龙诱导的OP大鼠模型的尿液使用HPLC-MS非靶向尿液代谢组学方法检测代谢产物时发现，肌酐、牛磺酸、甜菜碱、次黄嘌呤和胞嘧啶等是主要潜在的生物标志物，肌酐和甜菜碱在氨基酸代谢和能量代谢中起重要作用，牛磺酸是一种具有抗氧化作用的半必需氨基酸，能降低动物和人类的氧化应激，而且次黄嘌呤和胞嘧啶也参与能量代谢［23］。此外，同样是在使用强的松诱导OP的大鼠尿中利用代谢组学技术检测发现柠檬酸和n-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺含量降低可能与线粒体功能缺陷有关［39］。由此可知，以上标志物水平的改变提示了细胞的能量、氨基酸及核苷酸等的代谢障碍和氧化应激紊乱与OP的发生密不可分。另有研究发现，对364名绝经前后中国妇女的血清使用GC-MS技术检测代谢物水平时发现，由于5种游离脂肪酸的浓度变化与骨密度的变化密切相关，其分别为：油酸、亚油酸、花生四烯酸、11，14-二十碳二酸，而上述5种血清代谢物在绝经后骨质疏松症妇女中的水平显著高于绝经前骨质正常妇女中的水平［40］。所以，脂质代谢障碍与OP密切相关，说明脂质代谢谱对于OP的预测及早期诊断也有极大的帮助。无独有偶，在对去卵巢大鼠OP模型的研究中发现，模型组的戊二酰肉碱、LPC（18:1）和9-顺式维甲酸与对照组相比显著降低，也提示脂质的代谢障碍与OP有关，值得一提的是模型组中水平下降的9-顺式维甲酸（维甲酸的一种）可使大鼠的骨量下降［41,42］。而在另一个同样是对去卵巢大鼠的OP模型研究中发现，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，甲烷、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢以及半乳糖的代谢均与骨质疏松的发病密切相关［43］。还有研究发现，男性血清代谢物中的精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和肌氨酸等的水平变化以及绝经后女性血清代谢物中的精氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸等的水平变化均与骨密度的变化息息相关，同时结合肉碱在前二者的血清代谢物中的水平变化可知氨基酸及脂质的代谢障碍和OP的发生紧密相关［44］，此外将代谢物变化和传统的骨转化标志联合应用可进一步提高对OP的敏感性和早期诊断能力。

所以，结合上述的生物标志物和相关细胞能量、脂质、氨基酸及核苷酸等的代谢障碍可看出前二者和OP的发生密切相关，同时确证以及继续寻找新的生物标志物不但对OP的早期预测、诊断和预防骨折有极大的意义，而且有利于进一步探索OP的发病机制。

4 代谢组学在药物干预骨质疏松机制研究中的应用

根据研究报道，利用核磁共振检测激素诱导的OP大鼠血清中的代谢物时发现，脂质和乳酸的水平升高，肌酸/肌酐、PC、甘油磷脂酰胆碱（GPC）、牛磺酸、甘氨酸-葡萄糖的水平降低，而与治疗组对比发现淫羊藿逆转了上述代谢途径中的能量、脂质、氨基酸、磷脂代谢和肠道微生物紊乱，提示淫羊藿对改善OP有显著的治疗作用［45］。另有研究发现，当归补血汤(DBT)是一种常用来缓解PMOP的中药汤剂，体外培养的成骨细胞经DBT中的有效成分毛蕊异黄酮（calycosin）处理后，采用半制备HPLC对其代谢物检测时发现成骨分化标志物的表达显著增加，而当calycosin耗损时，DBT激活的Wnt/b-catenin和MAPK/Erk以及相关信号通路受到很大的影响，表明calycosin可能是DBT中不可或缺的化学物质，可以协调DBT的多种成分，实现最大的成骨性能［46］。还有研究发现，齐墩果酸可通过调节亚油酸以及氨基酸等的代谢促进成骨细胞的活性，增加骨形成，防止骨质丢失，增加骨密度［47］，而熟地黄则主要通过干预类固醇激素的生物合成及调节氨基酸代谢，从而改善松质骨结构，提高骨密度，改善骨代谢稳态［48］。但由于目前研究的药物大多数为中药单体，其具体的有效成分尚未明确，而针对有效成分的进一步研究对于抗OP药物的研发至关重要。

5 代谢组学在骨折疏松研究中的展望

目前对于OP发病机制的阐述需要进一步完善，而抗OP药物的研发尚处于起步阶段。然而，代谢组学技术的应用可更深入地研究OP的发病机制，寻找并确定与诊断相关的生物标志物，这对于早期预测及早期诊断OP，防止早期的骨质丢失，预防骨折以及预后的评价有重大意义。此外，利用代谢组学技术探索与OP相关的代谢途径、信号通路及特点靶点对于药物的研发也极其重要。