基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒

张华伟，周明光，侯真真，朱娴静，郝根喜，金建云，徐高原

武汉科前生物股份有限公司研发中心，武汉 430200

伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，其主要特征为患病动物体温升高、打喷嚏、呼吸困难和神经系统障碍[1]。猪是PRV的天然宿主和主要传染源。PRV可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，仔猪死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，养殖场一旦暴发伪狂犬病，就会造成巨大的经济损失。

目前，防制和净化PR的主要策略仍是接种疫苗。灭活疫苗和传统减毒活疫苗对早期PR的防控起到了一定的积极作用，尤其是Bartha-K61株弱毒疫苗，在2011年前对我国PR的防控起到了关键性作用。但灭活疫苗存在接种剂量大、免疫期短和免疫途径单一等缺点；传统弱毒活疫苗存在毒力返强、运输和保存条件受限等缺点。为此，研究人员进行了基因工程疫苗的研制，例如基因缺失弱毒疫苗、亚单位疫苗、嵌合疫苗，其中基因缺失弱毒疫苗相对成熟，我国研究人员已成功研制了一批具有自主知识产权的、技术先进并且效果良好的基因缺失弱毒疫苗[2-4]。

基因缺失弱毒疫苗主要是通过分子生物学的手段，对PRV基因组中毒力基因的若干碱基进行删除，使基因彻底失活。以往研制基因缺失弱毒疫苗主要是采用同源重组的方法，重组效率非常低，后期也需要花费大量的时间进行纯化。CRISPR/Cas9技术是最近几年在研究领域中极其热门的技术[5]，被广泛应用于病毒编辑、疫苗研制等方面。2016年，Tang等[6]利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TK、gE和gI基因缺失的伪狂犬病病毒。……