荧光定量PCR方法检测鸭疫里默氏菌在组织中的分布规律

陶志云，徐文娟，施祖灏，朱春红，章双杰，宋卫涛，刘宏祥，李慧芳*

(1. 江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州，225125；2. 谱尼测试集团江苏有限公司，江苏 苏州，215000)

鸭疫里默氏菌病是侵害水禽和其它鸟类的一种急性败血性传染病，以全身浆膜面发生纤维素性炎症为特征，其发病及死亡率高，急性病变多以死亡为转归，慢性病例多会耐过，但会失去经济价值[1-3]，因此，该病已成为危害水禽养殖业的一种重要传染病。目前，鸭疫里默氏菌病的临床诊断主要的方法是血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)和常规PCR检测等。由于鸭疫里默氏菌血清学众多，目前已报道的有21种血清型[4-7]，检测难度较大。SYBRGreen I实时荧光定量PCR使用特异性引物和SYBR Green I核酸染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，无需电泳，以其速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量等优点而被广泛应用于病原体检测[8-10]。本研究建立一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，根据鸭疫里默氏菌16S rRNA保守序列设计特异性引物，经优化反应体系和条件，建立检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR方法，并将该方法用于鸭疫里默氏菌感染后在组织中分布检测，为鸭疫里默氏菌感染机制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株培养 试验所用鸭疫里默氏菌菌株为ATCC11845标准株，菌株购自北京北纳创联生物技术研究院。冻存的菌株经活化后挑取单克隆，加入5 mL含5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养液中，37 ℃摇床中过夜培养，取2 mL菌液加入到200 mL的含有5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)培养液中，继续37 ℃摇床中过夜培养。……