度洛西汀对小鼠急性毒性及遗传毒性的研究

刘 旭，闫赋琴

(1.中国人民解放军总医院第三医学中心药品保障室，北京 100039； 2.中国人民解放军总医院医疗保障中心药剂科，北京 100853； 3.中国人民解放军总医院医疗保障中心采购办，北京 100853)

抑郁症属于情感性精神障碍，其病理生理机制较为复杂，到目前为止还未得以完全阐明。抑郁症在临床上是以显著而持久的心境低落为主要特征的临床综合征，具有高病残率和自杀率，并且易复发，给家庭和社会带来了极大的危害，并且随着我国老龄化日趋严重，老年抑郁症发病率明显升高[1]。5-羟色胺(5-HT)/去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂度洛西汀，是继氟西汀之后美国礼来公司重点研究的治疗抑郁症药物。该药自2004年被美国食品药品监督管理局批准可用于治疗成人重症抑郁症以来，目前已经成为临床一线抗抑郁药[2]。

根据药物的作用机制，度洛西汀主要是通过提高中枢神经系统中5-HT和NE的浓度，从而调控情感和对疼痛的敏感程度，达到改善抑郁症患者病情的目的，最终提高机体对疼痛的耐受力。度洛西汀口服后吸收迅速、完全，组织分布广且作用均衡。并且，度洛西汀抑制5-HT和NE的再摄取能力强，相比较选择性5-HT再摄取抑制剂而言，其对抑郁症治疗的有效率明显提高，不良反应远低于三环类抗抑郁药[3]。总体而言，度洛西汀的应用广泛且前景较好，但是目前对度洛西汀的生殖和相关的遗传毒性研究却很少。因此，本研究采用小鼠的骨髓微核试验、急性毒性试验和精子畸变试验，探讨度洛西汀的急性毒性及遗传毒性，为抗抑郁药的进一步研究提供一定的数据支持[4-9]。

1 材料

1.1 仪器

CX21型正置显微镜(日本奥林巴斯株氏会社);MEK-6318K型自动血球计数仪(日本光电工业株氏会社);BT1250型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 药品与试剂

度洛西汀购自美国Sigma公司；环磷酰胺购自浙江海正药业股份公司，生产批号为13040225。

1.3 动物

ICR小鼠，雄性，体重18～20 g，购自斯贝福实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK(京)2016-0001。

2 方法

2.1 小鼠急性毒性试验

ICR小鼠60只(SPF级)，随机分为6组，每组10只。进行试验前将小鼠禁食12 h(不禁水)处理。度洛西汀的起始剂量根据前期研究的预试验结果确定为150.5 mg/kg，所需浓度的溶液采用蒸馏水配制，给药容积为30 ml/kg，各组小鼠单次灌胃给予不同剂量的受试药物，在给药结束后观察药物对小鼠的毒性反应及持续的时间(1日1次，连续给药14 d)。记录ICR小鼠的毒性反应及死亡情况，选用Bliss法计算度洛西汀对小鼠急性毒性的半数致死量(LD50)及95%置信区间(CI)。

2.2 小鼠骨髓微核试验

SPF级雄性ICR小鼠60只，随机分为6组，即度洛西汀组(度洛西汀1、2、3和4组分别给予度洛西汀5、10、20和40 mg/kg，灌胃给药，1日1次，连续5 d)、阴性对照组(蒸馏水0.5 ml/20 g，灌胃给药，1日1次，连续5 d)和阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg，每日腹腔注射1次，连续给药5 d)。试验第5日给药1 h后，所有小鼠脱颈椎法处死，按文献[4]方法解剖小鼠，取出小鼠的股骨，制备小鼠骨髓细胞悬液的涂片，经甲醛固定和吉姆萨染色后放置于显微镜下进行观察，计算每只小鼠的骨髓涂片在10 000个嗜多染红细胞出现的微核细胞数，并计算微核细胞率(%)。

2.3 小鼠精子畸变试验

SPF级雄性ICR小鼠48只，随机分为6组，每组10只。分组与给药剂量及方法同“2.2”项，各组均连续给药5 d。在给药的第35日，取出所有小鼠的双侧附睾，按张宏等[5]的研究方法进行制片和伊红染色，并进行镜检。每只小鼠选用计数10 000个结构完整的精子为标准，记录精子的畸变数目(折尾、镰刀形、双尾、胖头和无钩等)，并依据精子的畸变数目计算畸变率(%)。

2.4 小鼠生殖与淋巴器官重量指数检测

经过微核试验与精子畸变试验后，分别摘取上述受试小鼠生殖系统的睾丸与附睾、胸腺与脾四部分器官，用滤纸处理后准确称重，计算器官重量指数。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 度洛西汀对小鼠的致死率和LD50的影响

本研究采用不同剂量的度洛西汀灌胃给药，采用Bliss法求得小鼠经口急性毒性给药的LD50和95%CI，结果见表1。度洛西汀灌胃给药的LD50为188.3 mg/kg，95%CI为148.0～202.9 mg/kg。

表1 度洛西汀对小鼠的致死率和LD50的影响(n=10)Tab 1 Effects of duloxetine on fatality rate and LD50 in mice (n=10)

3.2 度洛西汀对小鼠骨髓微核细胞率的影响

不同剂量(5～40 mg/kg)度洛西汀灌胃给药5 d后对小鼠骨髓微核细胞率的影响结果见表2。度洛西汀给药剂量达到40 mg/kg时，小鼠骨髓微核细胞率明显升高(20.45±3.22)%，与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.001)；度洛西汀灌胃剂量在5～20 mg/kg范围内时，并没有引起小鼠骨髓微核细胞率升高，与阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；而阳性对照组小鼠的骨髓微核细胞率明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 度洛西汀对小鼠骨髓微核细胞率的影响Tab 2 Effects of duloxetine on sperm micronucleus rate of mice

3.3 度洛西汀对小鼠精子畸变率的影响

度洛西汀1、2和3组小鼠精子畸变率与阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；度洛西汀4组(度洛西汀40 mg/kg)小鼠的精子畸变率与阴性对照组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 度洛西汀对小鼠精子畸变率的影响Tab 3 Effects of duloxetine on sperm malformation rate in mice

3.4 度洛西汀对小鼠生殖器官睾丸、附睾、胸腺及脾脏重量指数的影响

ICR小鼠灌胃给药第6日，度洛西汀组小鼠睾丸、附睾、胸腺及脾脏重量指数均未受影响，与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；阳性对照组小鼠各器官重量指数与阴性对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。灌胃第35日，度洛西汀组小鼠各器官重量指数均未受影响，与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；阳性对照组小鼠各器官重量指数均低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表4 不同剂量度洛西汀对ICR小鼠灌胃给药后第6日小鼠器官重量指数的影响Tab 4 Effects of different dosages of duloxetine on organ index of ICR mice on the 6th day after intragastric

表5 度洛西汀对小鼠用药后第35日小鼠器官重量指数的影响Tab 5 Effects of duloxetine on organ index of mice on the 35th day after administration

4 讨论

度洛西汀作为经典的5-HT/NE再摄取抑制剂，其具有疗效好、不良反应少等优点，市场占有率较高。抗抑郁药的用药时间较长，因此，其生殖及遗传毒性的研究显得更为重要。在女性患者使用抗抑郁药时，患者与医师特别注重其妊娠期用药的安全。而男性患者使用抗抑郁药时，药物对男性生殖功能的影响特别是对精子活性和质量的影响值得关注[10]。本研究采用啮齿类动物细胞遗传物质损伤的经典方法微核试验与精子畸变试验[8,11]，评估度洛西汀的急性毒性及遗传毒性。结果显示，度洛西汀在剂量≤40 mg/kg时，未对小鼠表现出潜在的遗传毒性作用[12]，不会引起小鼠骨髓微核细胞率与精子畸变率升高；当用药剂量≥40 mg/kg时，小鼠微核细胞率和精子畸变率均显著升高，提示高剂量度洛西汀对小鼠有较轻微的潜在遗传毒性[13]。此外，本研究检测了小鼠脾脏、胸腺和生殖系统的睾丸、附睾等器官重量指数，结果显示，各剂量度洛西汀对上述重量指数均无显著影响，提示在此剂量(≤40 mg/kg)范围内度洛西汀未对小鼠生殖器官产生影响。急性毒性试验是药物安全评价的重要部分。本研究中，度洛西汀对小鼠的急性毒性试验结果显示，LD50为188.3 mg/kg，95%CI为148.0～202.9 mg/kg。以上结果表明，度洛西汀在有效剂量范围内未出现不良反应，安全窗较宽。但当度洛西汀剂量≥40 mg/kg时，虽然短期给药和长期给药对小鼠无明显的器官毒性，但是高剂量度洛西汀对微核细胞率和精子畸变率的影响有轻微改变。因此，当临床上需要长期大量应用度洛西汀时，该药的遗传毒性应引起足够重视[14]。本研究结果可为抗抑郁药的应用提供思路和数据参考，也可作为开展其他药物遗传性生殖安全性评价研究的数据基础。