长翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物特性分析

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业农村部授粉昆虫生物学重点实验室，北京 100093）

1 引言

头部下唇腺分泌物（cephalic labial gland secretions，CLGS）是雄性蜂头部下唇腺分泌的标记性信息素，具有物种特异性，其在蜂王和雄性蜂交尾前的相互识别过程中起重要作用[1]。在自然状态下，熊蜂交尾前的化学通讯行为主要包括巡逻式飞行和气味标记两种方式[2]。雄性蜂通过头部分泌性外激素并将其标记在沿途的花叶、树枝和草茎上，引诱同种雄性蜂和新蜂王产生一定的行为或生理效应，其作用是协助完成交尾或促进种间生殖隔离[3]。因此，开展熊蜂的下唇腺分泌物挥发性成分分析，有助于了解熊蜂的化学通讯。

熊蜂的雄性蜂下唇腺分泌物成分主要为脂肪族化合物[4]。不同熊蜂种之间，亲缘关系较近的雄性蜂下唇腺分泌物成分比较接近。近年来已有文献报道了我国9 种本土熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物成分，分别为：亲熊蜂Bombus consobrinus、韩熊蜂B.coreanus、火红熊蜂B.pyrosoma、红光熊蜂B.ignitus、乌苏里熊蜂B.ussurensis、新疆地熊蜂B.terrestrisXJ、短头熊蜂B.breviceps、红尾熊蜂B.haemorrhoidalis和兰州熊蜂B.lantschouensis[5]。Bertsch 等分别对来自中国和欧洲的明亮熊蜂B.lucorum雄性蜂下唇腺分泌物挥发性成分进行了分析[6]。

长翅熊蜂B.longipennis主要分布在我国青藏高原及周边地区，对高海拔地区的高寒、低氧等极端环境条件具有较强的适应能力，对维持该地区植物的传粉具有重要作用[7-9]。同时，长翅熊蜂也是独具代表性的熊蜂复合种之一，在形态上和地熊蜂、明亮熊蜂、隐熊蜂等几种熊蜂极为相似[10]。本研究利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和气相色谱（GC）技术对我国长翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物进行定性和定量分析，明确其挥发性成分的种类和含量。该研究为进一步探究长翅熊蜂交尾行为的信息交流提供基础数据，同时，也作为一种辅助手段为熊蜂物种鉴定提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

长翅熊蜂雄性蜂新鲜样本采集于2019年中国农业科学院蜜蜂研究所熊蜂饲养室，在不同蜂群内随机采集雄性蜂共6 头，采集后迅速冻于液氮。用干净的镊子切取头部置于400μl 正己烷浸泡，室温萃取24h，保存于-20℃冰箱备用。测定前，将样品从冰箱取出置于冰上，移取100μl 萃取液用于气相色谱测定。

2.2 方法

2.2.1 气相色谱-质谱联用分析

使用Agilent 7200 气相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪（Q-TOF GC/MS）对分泌物中的挥发性成分进行定性分析。为避免主峰强度过高出现饱和现象，进样前将样品溶液稀释100 倍后，再进样分析。

气相色谱-质谱联用分析条件：色谱柱Agilent HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；进样量1μl；分流比：5∶1 或80∶1；EI离子源；电离能量：70eV；质谱扫描方式：全扫描；传输线温度：280℃；升温程序：初始温度70℃，保持1min；以15℃/min 速率升至160℃，保持3min；以10℃/min速率升至190℃；以3℃/min 速率升至225℃，保持5min；以15℃/min 速率升至300℃，保持3min。

2.2.2 气相色谱分析

使用Agilent 7890A 气相色谱仪（GC-FID）对分泌物中的挥发性成分进行定量分析。气相色谱分析条件：色谱柱Agilent DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；载气：高纯氮气（99.999%）；气体流速1ml/min；进样量1μl；不分流模式；升温程序：初始温度70℃，保持1min；以15℃/min 速率升至170℃，保持2min；以10℃/min 速率升至190℃；以3℃/min速率升至225℃，保持5min；以15℃/min 速率升至300℃，保持1min。

2.3 数据分析

使用Agilent MassHunter Unknowns Analysis 软件对雄性蜂头部下唇腺分泌物挥发性成分进行定性分析，通过解卷积方式自动检索谱库（National Institute of Standards and Technology，NIST 14）识别未知化合物，参数设置为默认。同时，为进一步确保化合物鉴定的准确性，使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 软件，手动逐一选择色谱峰，提取质谱图，扣除本底后检索谱库鉴定未知化合物。在两种方式的定性结果存在分歧时，优先选择后者。

挥发性成分的相对含量是由各化合物峰面积与总峰面积的比值计算得出，同时，对雄性蜂下唇腺分泌物挥发性成分气相数据进行优化，剔除相对含量小于0.1%的色谱峰。

3 结果

利用GC-MS 对长翅熊蜂雄性蜂头部下唇腺分泌物挥发性成分进行鉴定（图1），结果表明，共有28种挥发性成分，包括10 种醇类、8 种酯类、3 种烯烃类、3 种烷烃类、1 种醛类和3 种未知化合物。其中醇类化合物含量最高，平均相对含量为59.06%，其次为酯类化合物，含量为17.97%（表1）。

图1 长翅熊蜂下唇腺分泌物挥发性成分气相色谱图

利用GC 对长翅熊蜂雄性蜂头部下唇腺分泌物挥发性成分进行定量分析，结果表明，3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇含量最高，是长翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的主要成分，平均相对含量为38.45±3.68%。除此之外，9,12,15-十八碳三烯-1-醇、9,12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和二十八烷这3种挥发性成分的含量也较高，平均相对含量分别为11.36±0.61%、9.88±1.40%和13.31±2.19%。二十碳烯醇（3.94±0.34%）、13-二十二烯醇（1.79±0.18%）、月桂酸乙酯（2.74±1.58%）、十二酸-1-甲基乙基酯（2.71±0.64%）、十四醛（1.80±0.20%）、正二十一烷（3.29±0.28%）和三十一烷（1.50±0.47%）含量次之，平均相对含量在1%～5%。共有17 种挥发性成分含量较少，平均相对含量在0.3%～1%，分别为：1-二十醇、二十碳烯醇、蓝桉醇、正十六烷醇、5,8,11-十七碳三烯-1-醇、二十七烷醇、乙酸法呢醇酯、十七碳三烯酸甲酯、油酸乙酯、十八酸乙酯、碳酸异丁酯、1,7-十六烷二烯、十七碳-1,8,11-三烯、十七碳-1,8,11,14-四烯和3 种未知组分（表1）。

表1 长翅熊蜂头部下唇腺分泌物挥发性成分种类及相对含量

4 讨论

熊蜂雄性蜂性信息素是由雄性蜂头部下唇腺分泌的一种挥发性成分，作为一种化学通讯信号，在蜂王和雄性蜂交尾前识别过程中发挥着重要作用。本研究采用气相色谱-质谱联用和气相色谱技术对广泛分布于我国青藏高原地区的长翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的挥发性成分进行鉴定及相对含量的测定，明确其化合物种类和含量。该研究结果为深入探究熊蜂交尾前化学通讯机理提供基础数据，也为熊蜂鉴定提供依据。

2011年，Bertsch 等分别对来自中国和欧洲的明亮熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物成分进行了分析，基于分子数据和化学鉴定结果认为中国明亮熊蜂应为长翅熊蜂[6]。此外，该研究结果表明，长翅熊蜂下唇腺分泌物的主要成分为月桂酸乙酯，相对含量为31%，其次为3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇，相对含量为24%，以及油酸乙酯，相对含量为15%。在本研究中，6 头雄性蜂下唇腺分泌物也都检测到月桂酸乙酯，但其相对含量范围在1.02%～5.78%，并不能作为分泌物中的主要成分，与前人结果存在较大差异。另外，在Bertsch 等人的研究中，3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇（24%）是含量仅次于月桂酸乙酯的挥发性成分，但我们的研究结果表明3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇是长翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物中的主要成分，其相对含量范围高达32.22%～43.54%，造成这些差异的原因可能是由于雄性蜂的年龄差异。研究表明，不同年龄段的雄性蜂，下唇腺分泌物中主要成分的含量会发生变化，但种内差异仍低于种间差异[11]。熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物的成分和含量与粗面内质网、高尔基体和滑面内质网的数量有关，在年轻的个体中（小于1日龄的雄性蜂），粗面内质网是主要的分泌器官；对于1日龄雄性蜂，高尔基体是主要的分泌器官；大于2日龄的雄性蜂，滑面内质网是主要的分泌器官[12]。

雄性蜂下唇腺分泌物挥发性成分作为蜂王和雄性蜂交尾前的识别信号，其种类和含量在一定范围内存在较大的可变性。由于年龄、地理环境、采集时间、样本处理和仪器设备的不同，不同实验室的鉴定结果可能会存在一定差异。但即便是同分异构体之间的微小差异也可能在熊蜂交尾前的化学通讯中起关键作用，需要更多的样本和研究进一步验证[13]。本研究采用气相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱联用仪，通过精确质量数检索谱库鉴定化合物，与前人研究结果进行比较验证，以期明确下唇腺分泌物中稳定存在的挥发性成分。研究结果表明，在6 头长翅熊蜂雄性蜂头部下唇腺分泌物中含量比较高（平均相对含量＞1%）的成分共11 种，与Bertsch 等人研究中相对含量同样大于1%的10 种物质成分进行比较，共发现4种挥发性成分的鉴定结果完全一致，分别为：3,7,11-三甲基-6,10-十二碳二烯-1-醇、9,12,15-十八碳三烯-1-醇、月桂酸乙酯和十四醛[6]。我们认为，这4种挥发性成分稳定存在于长翅熊蜂下唇腺分泌物中，在长翅熊蜂蜂王和雄性蜂交尾前识别过程中可能发挥重要作用，其化学通讯机理有待进一步探究。

本研究报道了我国长翅熊蜂雄性蜂下唇腺分泌物的28 种挥发性成分，并明确其相对含量。熊蜂下唇腺分泌物主要挥发性成分在其交尾前相互识别过程中起着重要作用，故本研究对于长翅熊蜂主要挥发性成分在熊蜂交尾行为的化学通讯功能还有待进一步验证。此外，雄性蜂下唇腺分泌物中相对含量较低的挥发性成分也可能是熊蜂雄性蜂和蜂王交尾前化学通讯的关键物质，因此，探究这些微量成分在熊蜂化学通讯中扮演的角色也是今后重要的研究方向。