刺激隐核虫感染的免疫预防研究进展

摘要：综述了刺激隐核虫感染诱发的免疫应答及其免疫预防的研究现状，为开发阻断或减少刺激隐核虫感染的方法提供参考。研究显示，刺激隐核虫感染可以诱发宿主鱼的先天性和适应性免疫;利用刺激隐核虫的虫体（特别是幼虫）以及表面蛋白（或抑动抗原）的重组蛋白和真核表达的重组质粒DNA免疫宿主鱼，均获得了一定的相对免疫保护率（40%～100%）。今后应进一步研究鱼与刺激隐核虫之间的相互作用，以便综合利用鱼对刺激隐核虫的免疫应答，研发高效、多元化的刺激隐核虫病的防治方法。

关键词：刺激隐核虫;刺激隐核虫病;免疫应答;免疫预防

中图分类号：Q 95文献标志码：A文章编号：0253-2301（2021）02-0063-07

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102012

Research Progress on the Immunoprophylaxis of Cryptocaryon Irritans Infection

YU Lingying， HUANG Xiaohong*

（College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： The research status of the immune response induced by the infection of Cryptocaryon irritans and its immunoprophylaxis were reviewed， in order to provide reference for the development of methods to block or reduce the infection of Cryptocaryon irritans. The research showed that the infection of Cryptocaryon irritans could induce the innate and adaptive immunity of the host fish. The relative immune protection rate （40%-100%） was obtained by immunizing the host fish with the insect bodies of Cryptocaryon irritans （especially larvae）， the recombinant proteins of surface proteins （or immobilization antigens） and the recombinant plasmid DNA expressed in eukaryons. In the future， it is necessary to further study the interaction between fish and Cryptocaryon irritans， so as to comprehensively utilize the immune response of fish to Cryptocaryon irritans， and develop the efficient and diversified prevention and control methods of cryptocaryoniosis.

Key words： Cryptocaryon irritans; Cryptocaryoniosis; Immune response; Immunoprophylaxis

刺激隐核虫Cryptocaryon irritans是寄生在海水硬骨鱼身上的一种纤毛虫类原生动物，其生活史包括4个阶段：幼虫期、滋养体期、包囊前体期、包囊期[1]。幼虫在海水中游动以便寻找宿主。当遇到宿主时，幼虫可通过鱼躯干、鳃、鳍和眼等处表皮入侵宿主，并在鱼体表皮与真皮之间转化成滋养体。滋养体在鱼皮组织中吸收营养，发育成熟后离开宿主，脱落到海水中形成了包囊前体。包囊前体在海水中缓慢游动，到达海底或容器底部时会黏附在上面逐渐形成包囊。随后包囊开始不断地分裂繁殖，最终产生高达200个左右幼虫后，脱出包囊逸出到海水中继续寻找新的宿主，开始下一个生活史循环。在26～28℃环境下，刺激隐核虫以褐菖鲉Sebastiscus marmoratus作为宿主完成一个完整的生活史需要7～10 d的时间[2]。

被刺激隐核虫感染后，宿主鱼会表现出厌食、黏液分泌过多、在海水中冲撞、在网箱壁上摩擦止痒等异常行为，以及鱼体被感染部位出现充血等症状。随着虫体发育，在鱼体表、鳃、鳍和眼睛上会出现肉眼可见的白点，因此刺激隐核虫病也被称为“海水鱼白点病”[3]。当鳃上的黏液过多，阻碍了鱼的呼吸作用、水循环以及有害物质的排出，就会导致鱼的死亡。当宿主鱼感染严重的时候，免疫因子的释放受到抑制、器官组织功能紊乱从而导致免疫力的下降[4]。刺激隐核虫病还易继发细菌感染、炎症发生，如鳃表皮细胞的肿胀、增生，以及寄生虫接触区域的坏死脱落。

刺激隐核虫对于热带和亚热带海水硬骨鱼来说是一个主要的威胁[3]。由于野生环境中的鱼类密度通常较低，刺激隐核虫感染不易流行，因此危害不大。但是该虫很容易在高密度的海水养殖鱼中暴发感染，导致高死亡率，对海水鱼养殖业造成巨大的经济损失[5]。在福建省宁德市大黄鱼主产区，每年发病率达80%以上，经济损失约2亿元[6]。2008年，农业部将刺激隐核虫病认定为二级动物传染病。

近年来，学者们针对刺激隐核虫病的防治开展了许多研究。物理方法如间断性淡水处理、及时移除脱落到水族箱底的包囊等[7]，具有安全性较高、环境友好的特点，但是防治效果較弱，且在大水体中不易操作。Yin等[8]研究发现铜合金可以使刺激隐核虫包囊前体的细胞膜破裂、原生质溢出，经铜板处理后的刺激隐核虫细胞的酶活力显著降低，因此铜合金板可以有效地阻断刺激隐核虫生活史，是潜在的防治刺激隐核虫病的材料。常用的防治刺激隐核虫病的传统化学药物甲醛、孔雀石绿、次甲基兰、盐酸奎宁、硫酸铜、乙酸、双氧水、次氯酸钠、盐霉素、磺胺类抗生素等对刺激隐核虫都具有一定的杀伤效果[9-11]，但对宿主具有毒性且易造成药物残留、使细菌产生耐药性、易污染环境，并且孔雀石绿等药物已被政府明令禁止使用。我国中药文化有着数千年的悠久历史，近年来有学者研究辣椒、生姜、槟榔、复方中草药以及植物中的叶酸等对刺激隐核虫病防治效果[12-14]，发现它们对杀灭刺激隐核虫幼虫具有较好的效果，但难以杀灭包囊。因此，中草药疗法仅适用于刺激隐核虫形成包囊前的防治。

此外，许多学者以免疫预防为出发点尝试寻找防治刺激隐核虫病的突破口。已有的研究主要是以幼虫及刺激隐核虫表面膜蛋白为抗原免疫宿主鱼，证明了受免鱼能够产生特异性抗体，该抗体对幼虫具有阻动效应[15-17]，一定程度上为刺激隐核虫病的免疫预防方法研究提供了理论依据。然而至今研究工作者还未能找到真正有效的预防、控制和治疗该病的方法。本文综述了当前鱼类对刺激隐核虫感染的免疫应答及刺激隐核虫病的免疫预防研究进展情况，旨在为相关研究者了解硬骨鱼类感染刺激隐核虫的发病机理、筛选高效的免疫抗原及研发有效的治疗药物和疫苗提供参考。

1海水鱼对刺激隐核虫的先天性免疫应答

余玲莹等：刺激隐核虫感染的免疫预防研究进展2021年第2期2021年第2期余玲莹等：刺激隐核虫感染的免疫预防研究进展11Toll样受体信号通路

海水硬骨鱼对刺激隐核虫的感染会产生先天性免疫和特异性免疫反应[18]。先天性免疫系统主要由模式识别受体（PRRs）介导，可以特异性识别保守区域原相关分子模式（PAMPs）。在特异性免疫作出反应之前，先天性免疫在抗击病原体中占据了重要的作用。在硬骨鱼中主要有4种类型的模式识别受体，即Toll样受体（Tolllike receptors）、C型凝集素受体（Ctype lectin receptors）、NOD样受体（NODlike receptors）和RIGI 样受体（RIGIlike receptors）[19]。有研究表明，刺激隐核虫感染鱼宿主后，TRL的家族成员直接或间接地与PAMPs结合，随后与下游的Toll白介素1受体结构域（Tollinterleukin 1 receptor domain，TIR）相互作用，激活NFκB、MAPKs和IRFs等转录因子来诱导促炎因子和干扰素的表达，从而引发先天性免疫的发生[20]。

TLR2、MyD88和IL1β在TLR通路中充当信号导入、传导和信号导出的功能，斜带石斑鱼Epinephelus coioides被刺激隐核虫感染后，其感染部位和免疫器官中的TLR2、MyD88和IL1β表达量均上调;脾脏中TLR3的表达量在感染6 h 时显著上调并达到峰值，与TLR信号转导通路相关的基因EcMal和EcTRAF5同样在感染部位（鳃）和免疫器官（头、肾）中的表达量上调，说明TLR信号通路在宿主抗刺激隐核虫过程中占据了重要的作用[21]。而大黄鱼Larimichthys crocea在感染刺激隐核虫后，TLR5的表达量增加了111倍，其很可能参与到宿主识别抗原组分提高防御病原的作用，并且其表达水平可能与宿主感染寄生虫后的存活时间有关[22-23]。在先天性免疫中，这些信号传送到局部感染位置形成了炎症反应。

12趋化因子和细胞因子信号通路

在早期感染阶段，炎症反应在抗病原虫机制中占据了重要的作用。在被刺激隐核虫感染的大黄鱼肝脏转录组中，TNFα、IL1β、IL6、IFNα 和 IFNβ等促炎细胞因子以及CXCL10/12 和CCL19/20/25等趋化因子的表达量升高，促进炎症反应的发生;其他因子如TAK1、PIK3Ch和PIK3R等则可能为了避免炎症反应过度进行了负反馈调节[22]。斜带石斑鱼皮肤中的趋化因子CCL1、CCL4和CXCL911在感染后表达量上调，同时皮肤相关淋巴组织（SALT）召集了各类免疫细胞，免疫细胞迅速地迁移集中到感染部位形成一个局部免疫防御[24]。此外，在受染石斑鱼的鳃上有检测到大量非特异性免疫细胞，例如嗜酸性白细胞、中性粒白细胞、巨噬细胞[25]。作为最重要的吞噬细胞类型，中性粒细胞通过依赖氧的杀伤机制利用NADPH产生大量的活性氧ROS，氧化杀死大量的病原体，并且发现在感染部位免疫相关基因的表达要早于免疫器官相关基因的表达，说明当感染发生时，大量的吞噬细胞聚集在了感染部位，激活生物合成能力，触发了更强的免疫应答。随后吞噬细胞释放免疫因子，导致了炎症和免疫应答的发生，并进一步激活免疫器官的效应细胞，使得相关基因表达量增加[26]。

在先天性免疫的后期阶段主要由细胞因子和趋化因子驱动引起急性期反应（the acute phase response， APR）[27]。其中，细胞因子IL1β被认为是硬骨鱼中炎症免疫应答中最重要的调节因子，在抗刺激隐核虫的过程中具有重要作用。比如，感染刺激隐核虫后斜带石斑鱼Ecoioides的皮肤及卵形鲳鲹Tovatus的主要免疫器官肾脏、脾脏、肝脏、鳃和皮肤中的IL1β的表达量会显著增加[28]。此外，IL8、IL11、 IL34等细胞因子也参与到抗虫过程中[29-30]。虹鳟鱼Oncorhynchus mykiss皮肤中IL8的表达量在感染后第3 d顯著增加，并且中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞迁移到感染的部位并增殖，说明细胞免疫在感染72 h后被激活并对刺激隐核虫产生抵御作用[24， 30]。细胞因子和细胞因子受体交互作用通路贯穿整个刺激隐核虫感染过程，但细胞因子在抗虫过程中的具体功能仍有待进一步研究。

13抗菌多肽和替代补体途径

抗菌多肽 （AMPs）是先天性免疫的重要组分之一，是由宿主产生的多肽或者小分子蛋白，几乎存在于所有的生物体中，这些分子拥有强大的广谱抗菌活性，在防御病原体入侵宿主中占有重要的作用。近年来，有学者发现，在海洋生物的皮肤、鳃和肠道等表皮上拥有丰富的抗菌多肽，可以作为第一道防线防止病原微生物的入侵。大黄鱼Lcrocea肝脏的转录组表明，在刺激隐核虫感染过程中，AMPs家族中的Hepcidin、hepcidinlike、piscidin5like、piscidin5like type4 和BPI（Bactericidal permeability increasing protein）的表达量均上调以便大黄鱼防御刺激隐核虫的感染[31]。由此可见，抗菌多肽在刺激隐核虫的入侵宿主的过程中具有防御作用。混血柳鲈（Morone chrysops×Morone saxatilis） MCs中分离的Piscidin 2，使用剂量高于125 μg·mL-1时可以使刺激隐核虫幼虫出现肿胀、膜破裂、内容物溢出等现象[32]，说明piscidins作为AMPs家族最普遍的成员之一，具有很强的抗刺激隐核虫的活性。刺激隐核虫感染后，大黄鱼Lcrocea的Piscidinlike（LcPis）和piscidin 5like（LcP5L）表达上调并且对刺激隐核虫有致命作用，可以让其幼虫行动减缓、纤毛分开、细胞变形，使得幼虫和滋养体细胞膜破裂，胞质溢出[33-35]。因此，piscidins抗刺激隐核虫的作用机制值得进一步研究。

补体系统是由35种胞质溶解蛋白组成，在先天性免疫和适应性免疫中占据了重要的作用。有研究表明在应对刺激隐核虫感染的早期，鱼类主要通过激活替代补体途径（the alternative pathway，AP），当没有抗原抗体复合物形成的情况下，鱼的有机体缺乏C1、C2和C4，外源入侵物质直接激活C3，激活非特异性免疫AP途径[36]。Wang等[22]通过大黄鱼肝脏转录组证实了激活AP途径的FH和C3样基因在刺激隐核虫感染后表达量会显著上调。Dan等[37]也说明了刺激隐核虫感染可以调节斜带石斑鱼Ecoioides血液中的AP途径。在受染的铜锣鱼Nalbiflora中，FI、FH、FB和CD59等AP补体途径相关基因表达显著上调，而经典补体途径和凝集素补体途径相关基因的表达没有很大差别[38]。

2宿主对刺激隐核虫的适应性免疫应答

Yoshinaga等[39]发现刺激隐核虫免疫底鳉Fundulus heteroclitus sp后会产生免疫血清抗体。Luo等[15]发现对斜带石斑鱼Ecoioides进行腹腔注射和表面感染刺激隐核虫可以产生适应性免疫应答。适应性免疫应答主要通过B淋巴细胞和T淋巴细胞进行。目前为止，硬骨鱼类主要有3种由B细胞分泌的免疫球蛋白，即IgM、IgD和IgT/IgZ，其中IgM在硬骨鱼中的分布最为广泛[40-41]。T细胞主要有2种，为细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）和辅助性T细胞（helper T cells）。细胞毒性T细胞可以直接杀死被感染的细胞，辅助性T细胞主要通过分泌细胞因子来调节其他细胞。

斜带石斑鱼Ecoioides皮肤转录组分析发现：感染刺激隐核虫后，T细胞标志物CD4和CD48、B细胞标志物 CD22和CD81 以及B 细胞受体激酶Lyn的表达量上调，说明在皮肤感染部位T/B 细胞的存在且进行了扩增，此时适应性免疫应答发挥了作用[24]。研究还发现，注射过抗刺激隐核虫DNA疫苗的斜带石斑鱼Ecoioides脾脏中细胞免疫应答和体液免疫应答均被激活，MHCII、MHCI、CD4+、CD8α+、IFNγ、TNFα、IL12、IgM 重链和IgT重链的表达量均上调[42]，说明了免疫防治刺激隐核虫病是有效可行的，可以通过疫苗注射让宿主产生获得性免疫来防御刺激隐核虫的感染。在刺激隐核虫感染铜罗鱼Nalbiflora后期，CD34、IgM、IgD、IGH 和PIGR的表达量上调，CCR9、GZMB和IGH的表达量下调，在mRNA 水平说明了获得性免疫主要发生在感染后期[38]。因此，在免疫防治的过程中，不仅可通过疫苗来提高宿主的适应性免疫应答，同时在日常的养殖过程中还要保证宿主鱼的健康，提高它们的免疫力，发挥先天性免疫应答与适应性免疫应答的协同作用，达到有效防治刺激隐核虫病的目的。

3宿主对刺激隐核虫的皮肤黏膜免疫应答

硬骨鱼类的皮肤中含粘膜相关淋巴组织，不仅参与生理屏障作用，还可以产生先天性和适应性免疫应答。有研究表明，未被感染的铜罗鱼Nalbiflora的皮肤黏液可以杀死刺激隐核虫[38]，说明了铜罗鱼Nalbiflora的皮肤黏液中含有一些天然活性成分可以防御刺激隐核虫的感染。斜带石斑鱼Ecoioides感染和未感染的皮肤组织的转录组分析亦表明，一些免疫因子、趋化因子和趋化因子受体、TLR和Lyn都有显著的基因表达差异，说明了皮肤黏膜在对抗刺激隐核虫的感染过程中发生了免疫应答[43]。有报道认为，刺激隐核虫感染后，ILs在鳃中具有很高的表达量，可能因为鳃在感染过程中首先遭到病原攻击[44-45]，免疫因子迅速集中到感染部位诱发免疫应答。据此可以认为，在感染的早期阶段皮肤黏膜免疫应答在局部感染位置占据主要防御作用，同时某些海水硬骨鱼的皮肤黏膜中含有抗刺激隐核虫物质[38]，因此可以通过研究相关海水硬骨鱼的皮肤黏膜，找到抗刺激隐核虫的有效成分，从而应用于刺激隐核虫病的防治工作中。

4刺激隐核虫病的免疫防治

综上所述，刺激隐核虫感染诱发了鱼类宿主的先天性和适应性免疫反应。利用刺激隐核虫虫体为抗原，可使魚类宿主对刺激隐核虫（特别是幼虫）的再次感染产生免疫保护作用，最高可达到100%的相对存活率（RPS）[46]，为刺激隐核虫的免疫保护方法的研究带来了希望。

41以刺激隐核虫表面蛋白为抗原的疫苗研究

寄生虫的表面膜蛋白与宿主直接接触，常被认为是主要的免疫显性抗原，是潜在的疫苗候选分子[47]。因此研究者也克隆了多种刺激隐核虫的表面膜蛋白，由于这些表面膜蛋白的免疫血清对刺激隐核虫幼虫具有较好的阻动效果，也将它们称为抑动抗原（immobilization antigens，即Iantigen）。将这些表面蛋白作为抗原腹腔注射鱼体，可以使鱼类表达免疫相关基因，防御刺激隐核虫的感染。Hatanaka等[17]发现了幼虫和滋养体上的表面抗原（CISA32）;Lin等[48]从滋养体的cDNA文库中筛选了多种表面膜蛋白，利用大肠杆菌表达了刺激隐核虫表面蛋白的重组蛋白（rCiSA326），将它们作为抗原免疫小鼠后获得的鼠血清对刺激隐核虫幼虫具有较好的阻动效果。Mo等[49]通过刺激隐核虫的比较转录组分析发现了9种可能的表面抗原基因，为刺激隐核虫疫苗的制备提供了更多的可能。

同时，还有学者利用表达刺激隐核虫表面蛋白基因的真核表达质粒DNA作为抗原，也达到了不错的成效。Jose等[50]构建了DNA疫苗pcDNA31optiAg，肌肉注射后提高了宿主46%的相对存活率（RPS）。将iAg与刺激隐核虫Hsp70 C端区分别连到pcDNA31表达载体上共同免疫石斑鱼，在第20 d和第32 d利用刺激隐核虫进行攻毒可达到100%的相对存活率（RPS），免疫后49 d仍达到51%RPS防护能力[42]。

42以刺激隐核虫细胞骨架蛋白、蛋白酶为靶标的疫苗研究

细胞骨架的动态变化在原虫生长发育、入侵宿主过程以及成囊和脱囊等各种生理活动中起了重要的作用。刺激隐核虫的寄生阶段-滋养体是通过摄取寄生部位的组织碎片和组织液为生，因此猜测抗体也可随着滋养体的摄食进入细胞内。Huang等[51]从刺激隐核虫cDNA文库中筛选了肌动蛋白（CiActin）、肌動蛋白解聚因子（CiADF）、组装抑制蛋白（CiProfilin）等细胞骨架蛋白相关基因并进行了重组表达，评估重组蛋白对宿主的免疫保护效果;目前已报道了分别被重组的肌动蛋白解聚因子（CiADF2）和1433蛋白免疫后的鼠血清能够抑制刺激隐核虫幼虫的活性。

除此之外，蛋白酶在原虫的发育和感染的过程中占据着重要的作用。通过刺激隐核虫的转录组分析发现，在滋养体阶段，丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶具有很高的表达量，在122种的蛋白酶中有82种为半胱氨酸蛋白酶[49]。Watanabe等[52]通过在培养刺激隐核虫幼虫的介质中加入丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶抑制剂，发现刺激隐核虫发育、感染和入侵宿主的生命过程受到阻碍。进一步证实了这两种蛋白酶在刺激隐核虫的生长发育、感染和入侵宿主中拥有重要的作用，可以将其作为防治原虫的药物和疫苗潜在的靶向目标。虽然滋养体时期蛋白酶的详细信息有助于刺激隐核虫病防治方法的研发，但是相关蛋白酶的特性仍不够明确，还有待于进一步研究。

5展望

目前，许多学者在鱼对刺激隐核虫感染的免疫应答及刺激隐核虫病的免疫防治方面做了大量工作，也获得了一些成果。然而由于无法对刺激隐核虫进行实验室保种，传代的过程中也经常遇到困难，使得鱼与刺激隐核虫之间相互关系的研究进展缓慢。因此，为了找到高效安全的刺激隐核虫病的防治方法，未来还应从以下几个方面继续努力。（1）加深对刺激隐核虫发育规律、生活史不同时期特点的了解，以期找到刺激隐核虫的实验室保种方法，建立简单、可操作性强的大规模培养刺激隐核虫的方法，为制备幼虫灭活疫苗、实验室鱼与刺激隐核虫之间相互关系等研究奠定基础。（2）进一步开展海水鱼对刺激隐核虫感染的免疫应答机制研究。建议通过构建实验室模式动物，利用转录组学、蛋白质组学等生物学方法，从更深层次了解宿主鱼感染刺激隐核虫后的免疫应答及其机制，为疫苗研究奠定理论基础。（3）在深入了解刺激隐核虫生物学的基础上，开展多元化的疫苗研究，并将具有一定免疫效果的疫苗尽快应用到实际生产中，以验证其免疫效果。同时应将物理、化学和免疫预防手段相结合，建立一套切实可行高效的综合防治系统，以期早日解决刺激隐核虫病带来的问题。

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（责任编辑：柯文辉）

余玲莹，黄晓红刺激隐核虫感染的免疫预防研究进展＼[J＼]福建农业科技，2021，51（2）：63-69.

收稿日期：2020-12-26

作者简介：余玲莹，女，1995年生，在读硕士，主要从事发育生物学研究。

*通信作者： 黄晓红， 女，1963年生，教授，主要从事疾病的遗传与分子机制研究（Email：biohxh@fjnueducn）。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31672244）。