大豆LAZ1基因家族鉴定与GmLAZ1-9基因的功能研究

杨昕霞， 张 斌

(湖南科技学院 a. 后勤处；b. 化学与生物工程学院，湖南 永州 425199)

LAZ1(Lazarus 1)是真核生物中具有DUF300保守结构域的跨膜蛋白，在脊椎动物中作为有机溶质转运蛋白发挥功能[1]。但是，在植物中关于LAZ1家族基因功能的报道非常少。在拟南芥中，含DUF300域的蛋白质家族包含7个成员，其中仅LAZ1(AT4G38360，AtLAZ1-6)及其同源基因LAZ1H1(AT1G77220，AtLAZ1-3)的功能有明确报道。Malinovsky等[2]发现，LAZ1有助于拟南芥突变体acd11中细胞程序性死亡和由病原体触发的超敏反应的发生。LAZ1和LAZ1H1与一类保守的OST-α跨膜蛋白家族具有较高的同源性，而OST-α跨膜蛋白与动物中类固醇化合物的膜运输有关[3-4]。Liu等[5]研究发现，LAZ1和LAZ1H1基因功能的缺失会导致液泡形态缺陷、生长受到抑制和油菜素内酯信号的组成性激活。拟南芥laz1突变体的形态略小，但与野生型对照没有明显差异；而laz1laz1h1双突变体则表现出严重的生长抑制作用，说明拟南芥中LAZ1和LAZ1H1基因功能冗余或部分重叠，且对植物生长来说是必要的[5]。Liu等[1]在玉米基因组中鉴定出9个LAZ1家族成员，并对其进行了系统的生物信息学分析，证明玉米LAZ1家族基因的相对表达水平在不同组织和发育阶段表现出多样性，并且能够响应脱落酸(ABA)、干旱和NaCl处理。同时，玉米ZmLAZ蛋白(NP_001183680.1)能够与ZmSnRK2家族的8个成员相互作用[6]，而这些ZmSnRK2成员被确定为ABA信号传导途径的核心组成部分，并在非生物胁迫方面起着至关重要的作用[7-8]。但在本研究检索范围内，尚未见在植物中进一步验证LAZ1家族基因与非生物胁迫直接关系的报道。

植物在生长过程中经常会受到一些不利环境因素的影响，如干旱、盐、极端温度等。随着全球气候变暖，环境胁迫出现得更加频繁，且持续时间更长，这将对植物的生长、发育和农作物产量产生重大不利影响[9]。大豆是我国重要的粮油作物，同时也为动物饲料制造提供原料。盐害会影响大豆的正常生长，进而导致减产。目前，关于大豆响应盐胁迫的分子机制已有较多报道，涉及ABA信号途径、SOS信号途径、转录因子调控等[10]。但是，关于LAZ1家族基因在大豆盐胁迫中的功能研究尚未见报道。本研究从大豆基因组中鉴定出17个LAZ1家族基因成员，并对其染色体定位、基因和蛋白结构、启动子区的顺式作用元件、在不同组织的表达模式，以及盐胁迫诱导下的表达情况进行了分析，利用转基因拟南芥材料对GmLAZ1-9基因在耐盐性方面的功能进行研究，以期为进一步探究其他LAZ1家族基因的功能与分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验使用的植物材料包括栽培大豆(天隆1号)和哥伦比亚野生型拟南芥(Col-0)，双元表达载体为pFGC5941，大肠埃希菌感受态为DH5α，根癌农杆菌感受态为GV3101。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆LAZ1家族成员鉴定及其理化性质预测

根据已报道的拟南芥[5]和玉米LAZ1[1]家族成员的氨基酸序列，在大豆数据库(http://soykb.org/)进行BLAST比对，下载所有比对出的氨基酸序列，利用SMART数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)检查下载的氨基酸序列是否含有保守的DUF300结构域(PF03619)。利用ExPASy数据库(https://web.expasy.org/protparam/)对大豆LAZ1家族成员的理化性质，包括蛋白相对分子质量、总平均亲水性(GRAVY)、理论等电点(pI)和不稳定系数进行预测[11]。

1.2.2 染色体定位分析与系统进化树构建

大豆LAZ1基因家族成员在染色体上的位置信息从Phytozome v12.0数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info？alias=Org_Gmax)下载整理，大豆染色体总长度从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Glycine+max)下载。基于LAZ1家族基因的染色体位置信息及其所在染色体的总长度，利用Map Chart 2.2软件绘制染色体定位图。利用Clustal X和MAGA 7软件构建大豆、拟南芥、水稻和玉米LAZ1家族的系统进化树，参数设置如下：泊松模型，NJ(neighbor-joining)法，校验参数Bootstrap为1 000。

1.2.3 大豆LAZ1家族成员的基因和蛋白结构

在Phytozome数据库下载LAZ1家族成员的基因、蛋白质编码区(CDS)和蛋白序列。利用LAZ1的基因和CDS序列在GSDS网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构图；利用MEME数据库(http://meme-suite.org/tools/meme)分析大豆LAZ1家族蛋白的保守基序(motif)，参数设置如下：保守motif最小长度为6，最大长度为50，数量设置为10。

1.2.4 启动子顺式作用元件预测和大豆LAZ1家族基因的表达模式分析

下载大豆LAZ1家族成员ATG上游2 000 bp的序列作为启动子区，利用PlantCARE数据库分析启动子区的顺式作用元件，并统计能够响应非生物胁迫的元件类型与数量。LAZ1家族基因在不同组织(根、根毛、茎、茎尖分生组织、叶、花、果荚壳、种子、根瘤)中的表达数据从Phytozome数据库中进行整理，所有的FPKM值经公式ln(X+1)计算后用于表示基因的相对表达水平[12]，并利用Hem v1.0软件绘制基因表达热图。

利用半定量PCR检测大豆LAZ1基因响应盐胁迫的表达模式。使用150 mmol·L-1NaCl处理生长1周的大豆幼苗，于0、3、6、12 h时取样，用于RNA提取和基因表达检测，Actin基因(LOC100781831)作为内参基因。

1.2.5 过表达载体构建与拟南芥转化

使用高保真聚合酶克隆GmLAZ1-9基因的全长CDS序列，插入pFGC5941载体特定位点，获得过表达载体35S∶∶GmLAZ1-9。重组质粒经测序验证正确后导入根癌农杆菌GV3101，使用浸花法转化野生型拟南芥(Col-0)，经草铵膦筛选和PCR鉴定获得纯合的T3代转基因拟南芥材料，将其命名为OEGmLAZ1-9(T3)。

1.2.6 转基因拟南芥耐盐性分析

野生型拟南芥(WT)和转基因拟南芥(OEGmLAZ1-9)种子经75%乙醇消毒后，均匀播种于1/2MS培养基和含有200 mmol·L-1NaCl的1/2MS培养基上，于4 ℃暗置3 d，然后置于生长室培养7 d，统计萌发率。生长室条件：恒温25 ℃，长日照(昼16 h/夜8 h)，相对湿度50%～70%。拟南芥材料在营养土中正常生长4周后，用150 mmol·L-1NaCl水溶液处理7 d，拍照观察表型，利用Jia等[13]和Manzi等[14]报道的方法测定叶片相对含水量、丙二醛(MDA)含量与脯氨酸含量。

2 结果与分析

2.1 大豆LAZ1家族基因的鉴定与理化性质分析

本研究在大豆基因组中共鉴定到17个LAZ1家族成员，根据其在染色体上的先后顺序，依次命名为GmLAZ1-1～GmLAZ1-17。对LAZ1家族成员的理化性质进行分析(表1)，结果显示，基因长度在2 547～9 833 bp，氨基酸长度在287～492 aa，其中，GmLAZ1-9的基因长度最大(9 833 bp)，但却具有最小的氨基酸长度(287 aa)；蛋白的相对分子质量在32.65 ku(GmLAZ1-3)～55.25 ku(GmLAZ1-5)；等电点(pI)在4.35(GmLAZ1-7)～9.56(GmLAZ1-15)；不稳定系数在26.55～49.15，其中稳定蛋白(即不稳定系数小于40的)有4个，分别为GmLAZ1-6、GmLAZ1-9、GmLAZ1-14和GmLAZ1-15。

表1 大豆LAZ1家族基因成员的理化性质

2.2 大豆LAZ1家族成员的染色体定位、系统进化树、蛋白和基因结构分析

利用Map Chart 2.2软件绘制大豆LAZ1家族基因的染色体定位图，发现17个GmLAZ1家族基因分布在12条染色体上，其中6号染色体(chr6)上有3个成员，4、13和15号染色体上各分布有2个成员，其余8条染色体上均只有1个基因(图1-A)。为了研究栽培大豆LAZ1家族基因和其他物种的关系，本研究构建了大豆、玉米、水稻和拟南芥LAZ1家族成员的系统进化树，可将LAZ1家族分为3个亚家族(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，其中亚家族I包括8个大豆LAZ1家族成员，亚家族Ⅱ包括4个成员，亚家族Ⅲ包含5个成员(图1-B)。对大豆LAZ1家族成员的基因结构和保守motif进行分析发现，除GmLAZ1-3和GmLAZ1-15外，分布在同一亚家族的成员在基因结构和保守motif类型与分布方面基本一致(图1-C)。

A，大豆LAZ1家族基因的染色体定位；B，大豆和其他物种(拟南芥、水稻和玉米)LAZ1家族成员的系统进化树；C，大豆LAZ1家族蛋白和基因结构，及氨基酸保守基序分析。A， Chromosomal location of soybean LAZ1 family genes; B， Phylogenetic tree of members of the LAZ1 family of soybeans and other species (Arabidopsis， rice， and maize); C， Analysis of gene structure and amino acid conservative motifs of soybean LAZ1 family members.图1 大豆LAZ1家族成员的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of soybean LAZ1 family members

2.3 大豆LAZ1家族基因的组织表达和盐诱导表达模式

基于大豆数据库中LAZ1家族成员的基因表达FPKM值(数据库中无GmLAZ1-14的表达数据)，发现GmLAZ1家族基因在不同组织中的表达存在较大差异，GmLAZ1-9在9个组织(根、根毛、茎、茎尖分生组织、叶、花、果荚壳、种子、根瘤)中的表达水平均最高，GmLAZ1-8、GmLAZ1-11、GmLAZ1-13和GmLAZ1-17也表现出总体较高的表达水平(图2)。利用PlantCARE在线工具进一步分析GmLAZ1家族基因启动子区的顺式作用元件，发现存在很多与非生物胁迫响应相关的元件，如ABRE、ARE、LTR、G-box等(图3-A)。因此，利用半定量PCR检测了盐处理条件下大豆GmLAZ1家族基因的表达情况(图3-B)。GmLAZ1-5、GmLAZ1-9、GmLAZ1-11和GmLAZ1-13在盐处理后表达水平明显上升，其中GmLAZ1-9和GmLAZ1-13的表达量在盐处理6 h和12 h时明显高于0 h；GmLAZ1-5在盐处理3 h和6 h时表达上调，GmLAZ1-11在盐处理3 h时表达上调。

2.4 GmLAZ1-9基因过表达增强拟南芥耐盐性

本研究构建了GmLAZ1-9基因的过表达载体，利用农杆菌介导的浸花转化法获得了大豆GmLAZ1-9基因过表达的转基因拟南芥(T3代纯合子材料)。萌发实验(图4)表明，在正常1/2MS培养基上，WT和OEGmLAZ1-9拟南芥均可正常萌发，子叶展开，萌发率分别为93.4%和95.7%；而在含200 mmol·L-1NaCl的1/2MS培养基上，OEGmLAZ1-9的萌发率(26.3%)显著(P<0.05)高于WT(7.9%)。进一步对生长4周的拟南芥植株进行盐处理，发现WT和OEGmLAZ1-9的生长均受到抑制，叶片萎蔫，但OEGmLAZ1-9的长势优于WT。

右侧色彩刻度标尺代表基因表达量的高低，从灰到红色表示表达量数值从低到高。The color scale on the right represents the level of gene expression. From gray to red， the value of expression increases from low to high.图2 大豆LAZ1家族基因在不同组织中的表达模式Fig.2 Expression patterns of soybean LAZ1 genes in different tissues

A，大豆LAZ1家族基因启动子区与非生物胁迫响应相关的顺式作用元件；B，利用半定量PCR检测LAZ1家族基因在150 mmol·L-1 NaCl处理0、3、6、12 h时的表达情况。A， Abiotic stress-related cis-acting elements in the promoters of soybean LAZ1 genes; B， Expression of LAZ1 genes at 0， 3， 6， 12 h after treatment with 150 mmol·L-1 NaCl based on semi-quantitative PCR test.图3 大豆LAZ1家族基因启动子区的顺式作用元件与LAZ1家族基因在盐处理条件下的表达模式Fig.3 Cis-acting element in soybean LAZ1 gene promoters and expression patterns of LAZ1 genes under salt treatment

叶片相对含水量和MDA含量能够反映植物在胁迫条件下的受伤害程度：盐胁迫下叶片相对含水量越低，说明植物受伤害程度越大；MDA含量越高，表示植物受伤害越严重。渗透调节物质脯氨酸的积累有利于增强植物耐盐、耐旱的能力[13-14]。本实验测定了正常和盐处理条件下拟南芥叶片中的相对含水量，及脯氨酸和MDA含量。结果显示，盐处理条件下OEGmLAZ1-9拟南芥的叶片相对含水量和脯氨酸含量显著(P<0.05)高于WT，而MDA含量则显著(P<0.05)低于WT，说明过表达GmLAZ1-9基因的拟南芥在盐胁迫条件下受伤害程度较轻，其耐盐性更强。

野生型拟南芥WT和转基因材料OEGmLAZ1-9在1/2MS培养基和1/2MS+200 mmol·L-1 NaCl培养基上萌发7 d的表型(A)和萌发率统计(B)；生长4周的拟南芥(WT和OEGmLAZ1-9)在正常生长和150 mmol·L-1 NaCl溶液处理7 d的表型(C)、叶片相对含水量(D)、MDA含量(E)、脯氨酸含量(F)。D～F图中柱上标“*”的表示不同材料间差异显著(P<0.05)。Phenotype (A) and germination rate (B) of the wild-type Arabidopsis WT and the transgenic material OEGmLAZ1-9 seeds for 7 days on 1/2MS medium and 1/2MS+200 mmol·L-1 NaCl medium; Phenotype (C)， relative water content (D)， and content of MDA (E) and proline (F) of 4-week-old Arabidopsis(WT and OEGmLAZ1-9) grown in normal condition and 150 mmol·L-1 NaCl solution for 7 days. Bars in D-F marked with “*” indicated significant difference between test materials at P<0.05 under the same condition.图4 过表达大豆GmLAZ1-9基因增强转基因拟南芥的耐盐性Fig.4 Overexpression of soybean GmLAZ1-9 gene enhanced salt tolerance of transgenic Arabidopsis

3 结论与讨论

本研究从大豆基因组中鉴定出17个LAZ1家族基因，已报道的拟南芥和玉米中分别含有7个[5]和9个LAZ1家族成员[1]，而目前尚未见到关于其他植物LAZ1家族成员的全基因组学鉴定或单个基因功能的研究报道。通常认为，在系统进化树上聚集在同一亚家族的基因可能具有类似的功能[12]，大豆、玉米、水稻和拟南芥LAZ1基因家族成员在进化树上可分为3个亚家族(I、II和III)，已报道功能的拟南芥LAZ1(AT4G38360，AtLAZ1-6)及其同源基因LAZ1H1(AT1G77220，AtLAZ1-3)均属于I亚族，可推测此亚家族中的大豆GmLAZ1-2、GmLAZ1-3、GmLAZ1-4、GmLAZ1-5、GmLAZ1-7、GmLAZ1-10、GmLAZ1-12、GmLAZ1-14基因可能与拟南芥LAZ1和LAZ1H1具有类似的功能，在植物生长调控和油菜素内酯信号激活方面发挥功能。同一亚家族内各成员的基因和蛋白结构类似，推测GmLAZ1-3和GmLAZ1-15蛋白可能在进化过程中丢失部分功能域。这种情况在玉米中也有所体现，如ZmLAZ1-2仅含有1个保守motif[1]。植物基因的组织表达模式与其发挥的功能有紧密的联系。本研究发现，大豆LAZ1家族基因在不同组织的表达水平存在较大差异，其中GmLAZ1-9在所有组织中的表达水平均最高，GmLAZ1-8、GmLAZ1-11、GmLAZ1-13和GmLAZ1-17也表现出总体较高的表达水平，说明这些基因可能对大豆的生长发育非常重要。基因启动子上的顺式作用元件在调控植物生长发育和与环境互作方面起着非常重要的作用[15]，在GmLAZ1家族基因启动子区存在很多与非生物胁迫响应相关的元件，如ABRE、ARE、LTR、G-box、MYB、W-box[15-18]，并且GmLAZ1-5、GmLAZ1-9、GmLAZ1-11和GmLAZ1-13的表达水平受盐胁迫诱导上调，暗示了大豆LAZ1家族成员可能在盐胁迫响应过程中发挥着特定功能。Liu等[1]对玉米LAZ1家族基因的表达鉴定也发现，ZmLAZ1家族基因能够响应脱落酸、聚乙二醇(PEG)模拟干旱和NaCl胁迫诱导，表达水平上调或下调。

基于基因的组织和盐诱导表达分析结果，本研究对GmLAZ1-9的功能做了研究，发现盐胁迫下过表达GmLAZ1-9基因的拟南芥萌发率显著高于野生型WT。盐处理条件下，OEGmLAZ1-9拟南芥材料在营养土中的长势优于WT，叶片的相对含水量和脯氨酸含量显著高于WT，而MDA含量则低于WT，说明盐胁迫下OEGmLAZ1-9受伤害程度较轻，即在拟南芥中过表达GmLAZ1-9基因增强了转基因拟南芥对盐害的耐受性。但是，大豆GmLAZ1-9基因增强转基因拟南芥耐盐性的详细分子机制还需进一步探究。此外，其他大豆LAZ1基因是否也参与植物盐胁迫或其他非生物胁迫响应也是应继续关注的研究方向。