免疫抑制治疗对小儿重型再生障碍性贫血CD4+CD25+T细胞及相关细胞因子表达的影响

王俊，向健，熊丽

（1.天门市第一人民医院检验科，湖北 天门431700；2.天门市第一人民医院输血科，湖北 天门431700；3.天门市第一人民医院儿科，湖北 天门431700）

重型再生障碍性贫血（severe aplastic anemia，SAA）是由于造血干细胞受到损伤后引起的骨髓衰竭疾病，主要发病机制为自身免疫耐受失调、细胞免疫功能持续异常。CD4+CD25+T细胞是发生SAA最为重要的因子，同时，还属于身体中较为特殊的T细胞亚群。T细胞具有一定的免疫调节作用，且可维持身体免疫平衡，抑制免疫反应，因此，发生自身免疫性疾病时，存在T细胞功能及数量异常[1]。异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）和免疫抑制治疗（immunosuppressive therapy，IST）是SAA最主要的两种治疗方法，对缺乏合适同胞供者SAA患者一线治疗方案首选IST[2]。单独应用CsA治疗SAA起效慢，治疗后患者会出现牙龈增生、肝功能损伤、手震颤等不良反应。ALG是一种对免疫活性细胞具有多种作用的多克隆抗淋巴细胞血清，属于免疫调节剂，具有抑制和刺激淋巴细胞的双重作用，能直接作用于造血祖细胞使之增殖分化。以ALG为主的免疫抑制综合疗法是目前除造血干细胞移植外治疗SAA的主要方法，CsA联合ALG治疗SAA疗效显著，治疗后，患者不良反应少[3]。本研究旨在探讨免疫抑制治疗对小儿重型再生障碍性贫血CD4+CD25+T细胞及相关细胞因子表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2017年1月至2019年4月天门市第一人民医院收治的重型再生障碍性贫血患儿74例，采用随机数字表法分为研究组和对照组，每组37例。对照组男19例，女18例；年龄2～7岁，平均年龄（6.43±0.21）岁。研究组男21例，女16例；年龄3～8岁，平均年龄（6.56±0.33）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义，具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。纳入标准：①入院后经过医师诊断、外周血象、骨髓涂片、活检等确诊；②患儿临床资料完整，依从性较高；③符合《再生障碍性贫血诊断与治疗中国专家共识（2017版）》[4]中关于重型再生障碍性贫血的诊断。排除标准：①近6个月内患儿使用过免疫抑制剂、皮质类固醇激素；②患有心、肝、肺、肾等器官不全；③患有血液系统疾病。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法对照组给予环孢素A（Ciclosporin A，CsA；福建科瑞药业有限公司，国药准字H10930026，规格：50 mL∶5 g）治疗，口服3～5 mg/（kg·d），分2次口服，连续治疗6个月。研究组在对照组基础上联合抗淋巴细胞球蛋白（Antilymphocyte globulin，ALG；武汉生物制品研究所，国药准字S20040023，规格：0.25 g/支）治疗，将本品稀释于250～500 mL氯化钠注射液中（幼儿酌减稀释用的氯化钠注射液量），静脉滴注，开始速度为每分钟5～10滴，如10 min后无不良反应，再逐渐加速，全量在1～2 h内输完。两周1个疗程，治疗6个月后评价效果。

1.2.2 标本采集与检测空腹采集两组外周EDTA抗凝静脉血两管（每管5 mL），肝素抗凝血一管（3 mL）备用。其中一支EDTA抗凝血管中加入5 mL RPMI1640液混匀，另一管EDTA抗凝静脉血中加入5 mL淋巴细胞分离液，将上述混匀的全血加入分离液的上层，离心分离单个核细胞。调整细胞浓度为（5～10）×106/mL，取30μL细胞悬液于流式管中，分别加入CD4-FITC、CD25-PE单克隆抗体5μL，放入暗室表染30 min，染色缓冲液洗涤2次，加1%的多聚甲醛固定，用流式细胞仪[美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪，同公司的试剂盒（批号：50028）]对CD4+T、CD25+T、CD4+CD25+T细胞进行检测。采用ELISA法对肝素抗凝血进行血清IL-10、IL-35、TGF-β水平检测。

1.3 观察指标①比较两组治疗6个月后CD4+CD25+T细胞和T淋巴细胞亚群表达。②比较两组治疗6个月后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平。③比较两组治疗6个月后的治疗效果。显效：抑制与免疫反应有关细胞的增殖和功能，降低机体免疫反应，再生障碍性贫血情况有明显好转；有效：患儿抵抗能力提高，再生障碍性贫血正在逐渐好转；无效：患儿再生障碍性贫血无改善，甚至疾病更加严重。总有效率=显效率+有效率。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验，计量资料以“±s”表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CD4+CD25+T细胞和T淋巴细胞亚群表达比较治疗6个月后，研究组CD4+T、CD25+T、CD4+CD25+T、CD4+CD25+T/CD4+T均低于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组CD4+CD25+T细胞和T淋巴细胞亚群表达比较（±s，%）Table 1 Comparison of the expression of CD4+CD25+T cells and T lymphocyte subsets between the two groups(±s,%)

表1 两组CD4+CD25+T细胞和T淋巴细胞亚群表达比较（±s，%）Table 1 Comparison of the expression of CD4+CD25+T cells and T lymphocyte subsets between the two groups(±s,%)

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2.2 两组治疗前后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平比较治疗后，研究组血清IL-10、IL-35、TGF-β水平均低于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 两组治疗前后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平比较（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IL-10、IL-35 and TGF-βlevels between the two groups before and after treatment(±s,ng/L)

表2 两组治疗前后血清IL-10、IL-35、TGF-β水平比较（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IL-10、IL-35 and TGF-βlevels between the two groups before and after treatment(±s,ng/L)

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2.3 两组治疗效果比较治疗6个月后，研究组治疗总有效率高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 两组治疗效果比较[n（%）]Table 3 Comparison of treatment effect between the two groups[n(%)]

3 讨论

再生障碍性贫血属于骨髓造血障碍性疾病，患者会出现骨髓容量减少及全血细胞减少情况，同时伴有出血、乏力和发烧等临床症状，其发病与环境及饮食因素有关。有研究[5]指出SAA与患者自身CD4+T细胞功能亢进具有相关性，但目前其发病机制尚无明确定论。T淋巴细胞免疫功能的变化、表型、数量的变化与SAA具有关联性，相关学者研究发现SAA发病机制可能和Th具有一定关系，这是由于T淋巴细胞的免疫能力不断被打破，r-IFN、IL-2、TNF-α等造血调控因子的分泌不断增加所致[6]。由于CD4+CD25+T细胞可以根据免疫抑制作用抑制自身反应性T细胞的活化，保持免疫平衡，当发生自身免疫性疾病时，如特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、系统性红斑狼疮、多发性硬化病、I型糖尿病等，则会导致患者的CD4+CD25+T细胞功能和数量明显降低[7]。

环孢素A是真菌的代谢产物，属于环寡肽，可用于肝、肾、心脏等免疫系统引起的排异反应。在治疗再生障碍性贫血时，环孢素A能对免疫系统的排异反应起到良好的中和效果。同时，环孢素A可选择性抑制辅助T淋巴细胞，恢复T淋巴细胞亚群平衡，阻止炎症因子合成与释放，进而促进患者骨髓造血功能损伤程度降低，但单独环孢素A治疗具有可逆性。抗淋巴细胞球蛋白属于免疫抑制剂，可直接刺激造血干/祖细胞生长，改善骨髓造血功能，通过补体依赖的细胞溶解作用，促进T细胞凋亡，起到清除T细胞的目的。

本研究结果表示，治疗后，研究组CD4+T、CD25+T、CD4+CD25+T、CD4+CD25+T/CD4+T均低于对照组（P＜0.05），表明在药物联合治疗后患者的造血功能逐步恢复，CD4+CD25+T细胞水平逐步恢复正常，说明此细胞和重型再生障碍性贫血的发生密切相关。这可能是由于CD4+CD25+T细胞是通过分泌免疫调节因子不断调节Th和T细胞群来控制自身的反应性所致。当患者机体中的CD4+CD25+T细胞比例发生失调后，相应的细胞就会不断减少，抑制IL-2的能力也会下降，机体免疫耐受作用随之下降，机体中的活性T细胞出现繁殖，CD4+CD25+T细胞的比例会出现紊乱，机体的体液免疫随之亢进，最终引起重型再生障碍性贫血的发生[8]。治疗后，研究组患儿血清IL-10、IL-35、TGF-β水平均低于对照组（P＜0.05），这可能是由于CD4+T细胞的数量增加后，CD8+T、CD4+T细胞的比例出现失衡现象和免疫偏移等，从而促使造血微环境调节因子出现失衡。调节性T细胞（regulatory cell，Treg）是一类具有显著免疫抑制作用的CD4+T细胞亚群，血清IL-10、IL-35、TGF-β是Treg分泌的主要细胞因子，能抑制其他细胞的免疫应答、减少炎性因子分泌，促使患者机体自身免疫耐受。当发生SAA时，患者的Treg的功能和数量均发生异常，CD4+T细胞功能不能被抑制，而经过免疫联合治疗后CD8+T、CD4+T细胞的比例逐渐平衡，CD4+T细胞功能，Treg的功能和数量逐步恢复正常，血清细胞因子随之减少[9]。研究组治疗总有效率高于对照组（P＜0.05），说明两种药物能发挥良好的协同作用，相互补充，促进药效。这是因为CsA能有效抑制T细胞表达IL-2受体，抑制T淋巴细胞构成，抑制负调节因子，从而恢复造血功能。而ALG能与淋巴细胞结合，在补体的共同作用下裂解淋巴细胞，从而抑制细胞介导的免疫反应，提高免疫防护。有学者研究发现，ALG对造血干细胞的表面作用可帮助造血生长因子，提高敏感性，使造血功能更早恢复[10]。

综上所述，在小儿重型再生障碍性贫血治疗的过程中，免疫抑制治疗效果较为理想，值得临床推广应用。