UPLC-MS／MS法可同时测定化妆品中8种大环内酯类及林可胺类抗生素

王宁 章宦胜 隋玉杰 唐玉红

目前的化妆品抽检主要是以《化妆品安全技术规范》（2015版）为依据，其中仅提供了部分抗生素的检测方法，如甲硝唑、氯霉素、盐酸美满霉素、二水土霉素、盐酸四环素等，对于大环内酯类和林可胺类抗生素，检测方法尚未涉及。作者选取了乳液和面霜类化妆品样品，对化妆品中8种大环内酯类及林可胺类抗生素的检测方法进行了系统性试验，证明这种方法操作简单、分离效率高、回收率稳定，可有效为化妆品中多种抗生素检测提供技术支持，也可为化妆品中抗生素测定相关标准的制定奠定基础。

抗生素由于其良好的抗菌作用和非特异性抗炎作用，在皮肤科治疗中表现出较好的疗效。一些化妆品生产者利用这类物质的治疗特性，向化妆品（特别是祛痘类化妆品）中非法添加抗生素，以呈现又快又好的效果，而《化妆品安全技术规范》（2015版）将抗生素规定为禁用物质，原因在于抗生素长期使用可能造成耐药性、菌群失调，甚至损害肝肾功能等后果。在近几年国家药品监督管理局对化妆品的抽查中发现，抗生素检出频频出现，2018年初即公布了21批次祛痘化妆品的抗生素检出情况。但是，目前的化妆品抽检主要是以《化妆品安全技术规范》（2015版）为依据，其中仅提供了部分抗生素的检测方法，如甲硝唑、氯霉素、盐酸美满霉素、二水土霉素、盐酸四环素等，对于大环内酯类和林可胺类抗生素，检测方法尚未涉及。而大环内酯类和林可胺类抗生素是皮肤科较为常用的两类药物：大环内酯类抗生素具有优良的抗炎作用，已被广泛应用于银屑病、痤疮、玫瑰糠疹、酒渣鼻等皮肤病的治疗中;林可胺类抗生素则被各大医院用于制成治疗痤疮、皮肤分泌异常等疾病的制剂，疗效显著。一些化妆品中若添加了这两类抗生素，则会因为没有相应的检测标准而躲避监管部门的检查，因此有必要通过研究建立两类抗生素的检测方法标准。目前，已有少量文献报道了对化妆品中部分林可胺类抗生素进行测定的方法，如克林霉素、林可霉素等，方法主要为液相色谱法和液相色谱一串联质谱法。液相色谱一串联质谱法因其高分离、高灵敏度、应用范围广、专属性强等特点，在化妆品抗生素检测方法研究方面应用越来越广泛。本研究采用超高效液相色谱一串联质谱法（UPIC-MSIMS）对化妆品中的红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯同时进行测定。该方法的建立可为化妆品质量安全监控提供技术支持。

本文采用超高效液相色谱一串联质谱法建立了对化妆品中8种大环内酯类及林可胺类抗生素（红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯）同时进行测定的方法。样品经乙腈涡旋分散、超声、冰浴处理、离心、上清液稀释过滤后进行UPLC-MS/MS仪器分析。8种抗生素在5-100 Ug/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997，检出限为1-20 Ug/kg。8种被测物质的平均加标回收率为80.0%～106.9%，精密度为0.6%-10.9%。该方法操作简单高效、稳定性好，可用于化妆品中抗生素的快速测定。

一、测定仪器与试剂

1.主要试验仪器

超高效液相色谱一串联质谱仪（1290 Infinity11/6495，Agilent Technologies，Inc.）、涡旋振荡器（VortexTM-1， WiggensGmbH）、超声波发生器（P120H，ElmaSchmidbauer GmbH）、高速离心机（3K15，SigmaLaborzentrifugen GmbH）、 电子天平（CPA225D，Sarto rius G roup）。

2.主要试剂

红霉素、克拉霉素标准品（Dr.Ehrenstorfer GmbH），阿奇霉素、罗红霉素标准品（上海安谱实验科技股份有限公司），林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯对照品（中国食品药品检定研究院），吡利霉素标准品（Toronto ResearchChemicals Inc.），甲醇、乙腈（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司），甲酸（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）。

3.标准溶液配制

单组分标准储备溶液：分别称取适量的红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、林可霉素、克林霉素、吡利霉素、克林霉素磷酸酯标准物质溶于甲醇中，配制成浓度为1000mg/L的单组分标准储备溶液。

混合标准储备溶液：分别吸取0.1 mL各单组分标准储备溶液于IO mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为IO mg/L的混合标准储备溶液。

混合标准中间溶液：吸取I.O mL混合标准储备溶液于IO mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为l mg/L的混合标准中间溶液。

混合标准工作溶液：分别吸取5 UL、10 UL、20 UL、50uL、100 UL混合标准中间溶液，用空白样品前处理所得基质溶液定容至1.0 mL，配制成5 Ug/L、10 Ug/L、20 ug/L、 50Ug/L、 100 Ug/L浓度系列混合标准工作溶液。

二、试验方法

1.样品前处理

称取样品Ig（精确至l mg）置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈后密閉，涡旋使之分散均匀，超声提取10min。冰浴处理20 min，在5。C下以7000 r/min的转速离心5 min，吸取500 UL上清液于5mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，所得稀释液用0.22 um有机滤膜过滤净化，移取适量净化后溶液至进样瓶中密封，供UPLC-MS/MS测定。

2.色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus Cl8 （3.0 mmXlOO mm，3.5 um）;进样量：5 uL;流速：0.2 mL/min;柱温：30℃;流动相：A：0 .1%甲酸水溶，B：乙腈;梯度洗脱程序见表L后运行时间为2 min。

3.质谱条件

离子源：电喷雾离子源;扫描方式：正离子扫描;监测模式：多反应监测（MRM）;毛细管电压：4000 V;干燥气温度：200℃;干燥气流速：II L/min;雾化器压力：35 psi。各被测物质的多反应监测参数见表2，所得8种抗生素混合标准工作溶液的MRM谱图如图l所示。

三、结果与讨论

1.线性范围与检出限

采用确定好的仪器方法，对按照标准溶液的配比步骤配制成的5 ug/L、10 u9/L、20 ug/L、50 ug/L、100 ug/L浓度系列混合标准工作溶液进行UPLC-MS/MS测定。以标液浓度为横坐标、各被测物质色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，所得8种被测物质的标准曲线线性回归方程见表3。由表3可以看出，8种被测抗生素在5-100 Ug/L浓度范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.997。通过对空白样品加入浓度逐渐降低的标液进行试验测定的方法，并以信噪比3为条件确定检出限，所得8种被测物质的检出限见表3，为1-20 ug/kg。

2.回收率与精密度

采用乳液类和面霜类空白样品进行加标回收试验，添加水平为0.5 mg/kg、 2.5 mg/kg和5 mg/kg，每个样品每个添加水平开展6次独立重复试验，所得平均回收率和精密度见表4，其中精密度以相对标准偏差（RSD）表示。从表4的结果来看，8种被测抗生素的平均回收率为80.0%-106.9%，精密度为0. 6%-10.9%。结果表明，该方法准确度较高，精密度良好。

3.实际样品的检测

通过网络购买收集了20批次化妆品，主要为标称具有祛痘、修护、敏感肌护理等功效的乳液和面霜类产品。用本研究方法对该20批次样品进行8种大环内酯类及林可胺类抗生素测定，结果显示：1批次面霜样品有克林霉素磷酸酯检出，l批次面霜样品中有林可霉素检出。

小结

本研究利用超高效液相色谱一串联质谱法实现了对化妆品中8种大环内酯类及林可胺类抗生素的测定。本研究建立的试验方法操作简单，可在短时间内达到8种被测物质的有效分离，在5-100 ug/L浓度范围表现出良好的线性，回收率稳定、准确高效。该方法可为化妆品中多种抗生素检测提供技术支持，也可为化妆品中抗生素测定相关标准的制定奠定基础。编后语

这篇论文看似专业，实际上不是为了试验而试验，而是着眼于实用，以消费者用妆安全和化妆品抽检方法的完善为目的。言有限，而思无限。大众消费者，无论是关注产品成分与功效的“成分党”“功效党”，还是紧跟消费潮流的消费者，通过这篇论文可以看到中国化妆品人在市场背后的思考与努力，提高对中国化妆品法规与监管等的信心。化妆品生产商、品牌商、经销商等亦可收获警醒之心，国家与业内专家一直致力于完善化妆品监管的法规、标准与方法，可钻的空子越来越少，唯有合法合规方是正道。CCR

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