加权基因共表达网络识别子宫内膜癌中与肿瘤干细胞干性相关的基因

黄小燕，苏琪盛，丘程程，朱尚勇

（广西医科大学第一附属医院超声科，广西 南宁 530021）

0 引言

子宫内膜癌(UCEC)是女性三大妇科恶性肿瘤之一。近10年，UCEC的死亡率年增长率约1.4%，其发病率逐渐上升[1]。子宫及双侧附件切除是UCEC的标准治疗手段，对于远处转移的患者，辅以放、化疗及激素治疗，这些治疗手段给患者创伤性大。分子靶向治疗因其创伤小、疗效优的特点，成为有效的UCEC治疗策略。因此，鉴别UCEC特异的分子标志物实现分子靶向治疗尤显重要[2]。然而，由于对UCEC的组织病理学分类和异质性认识不足，识别其分子生物标记物仍具挑战。

肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤中具有自我更新、高增殖和多向分化潜能的一类细胞，具有促肿瘤复发、转移和耐药的作用[3]。CSCs的干性与多数癌症的肿瘤内异质性相关。肿瘤内异质性包含细胞表面标记物及表型异常，而细胞表面标记物以及基因突变类型常被认为是肿瘤病理分类和治疗的依据[4]。有研究表明UCEC的发生与CSCs的干性有关[5]。本研究着重于从CSCs干性特征的角度识别与UCEC的组织病理学分类和异质性相关的特征基因。

1 材料与方法

1.1 数据收集及处理

UCEC患者的纳入标准：（1）组织病理学证实为原发性UCEC患者;（2）完整RNA-Seq数据及临床数据的患者（如年龄，病理分级、生存时间）。排除标准：（1）非原发性UCEC患者;（2）临床资料不完整。本研究纳入23个正常子宫内膜组样本及552个UCEC样本。

1.2 mRNAsi与UCEC的临床病理的相关性

mRNAsi用于评估肿瘤细胞的去分化程度，mRNAsi值经过1类逻辑回归机器学算法得到[3]，其值的区间为[0，1]，值越趋近于1，则表示肿瘤细胞与干细胞的相似程度越大。根据肿瘤样本的mRNAsi的中位数将患者分为高mRNAsi组与低mRNAsi组，并通过R语言中的“survival”包进行生存分析。Wilcoxon秩和检验分析UCEC病理分级与不同年龄间mRNAsi值的差异。最后采用R语言中的“beeswarm”包进行结果可视化处理。

1.3 UCEC中的差异表达基因分析

通过Wilcoxon秩和检验筛选样本的差异基因，筛选标准：假阳性率(FDR)＜0.05及|log2(FC)|≥1。FC为样本表达量的差异倍数。

1.4 WGCNA模型构建与模块筛选

运用R语言中的“WGCNA”包构建具有近似无尺度特性的加权基因共表达网络（WGCNA），筛选与肿瘤干细胞高度相关的模块[6]。通过hclust函数对样本进行聚类分析，使用pickSoftThreshold函数确定软阈值，设定模块中最小基因数为30，切割高度的阈值为0.25，采用拓扑重叠（TOM）计算，并运用动态切割法识别共表达基因模块[7]，构建模块树状图。

1.5 枢纽基因的筛选

选择与临床性状相关性最高的模块，计算模块内每个基因的基因显著性（GS）与模块隶属度（MM）的相关性，设定筛选模块内关键基因的阈值为MM＞0.8，GS＞0.5。

1.6 GO、KEGG富集分析及蛋白质（PPI）网络互作分析

GO和KEGG分析对关键基因行功能注释及通路富集[8]，采用“clusterProfiler”包进行富集分析。当FDR＜0.05时，认为结果具有统计学意义。通过在线工具STRING（https://www.string-db.org/)[9]进行蛋白网络互作分析（PPI），并用Cytoscape软件实现可视化[10]。PPI中关键节点的筛选阈值为最低筛选分数≥0.8。以节点数最高的基因作为枢纽基因。

1.7 统计分析

运用R软件进行数据处理和统计学分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义

2 结果

2.1 mRNAsi与临床特征及预后的相关性分析

与正常子宫内膜组比较，肿瘤组的mRNAsi表达量与UCEC患者的病理分级及年龄（以65岁为界）成正相关（P＜0.001）（图1A 和 B）。

图1 mRNAsi与UCEC患者临床病理分级及年龄的相关性

2.2 差异基因筛选

在TCGA数据库中得到575个样本（包括552个UCEC组及23个正常组），筛选出6267个差异表达基因，包括2406个下调基因和3861个上调基因（图2）。

图2 差异基因的筛选：红色基因代表在样本中上调的基因，绿色表示下调的基因

2.3 WGCNA筛选关键模块与基因

根据“WGCNA”包对样本行聚类分析获得16个关键模块。为了保证无尺度网络的准确性，其筛选的软阈值为4（R2=0.95）（图3A）。通过动态剪切树算法分割模块，形成模块树状图（图3B），计算16个模块内的基因与mRNAsi及表观调控的mRNAsi（EREG-mRNAsi）的相关性，其中蓝绿色模块与mRNAsi呈明显的正相关且相关系数最高（图3C，r=0.70,P=4e-80），棕色模块与mRNAsi呈显著负相关（r=-0.55,P=2e-42）。因此，我们选择蓝绿色模块进行分析筛选得到关键基因（图3D）。以 MM＞0.8，GS＞0.5为筛选标准，共得到 44个与肿瘤干细胞干性相关的基因（P＜0.01），这些基因在UCEC组中上调（图4A，B）。在这44个基因的相关性分析结果中，DEPDC1和CENPI及CENPE 的相关性最高(r=0.87)（图4C）。

2.4 蛋白互作网络及功能富集分析

对44个基因构建蛋白互作网络（PPI），运用Cytoscape软件进行可视化处理，节点数最多的10个基因为TTK、NCAPH、NCAPG、KIF15、KIF11、CDCA8、CCNB1、CCNA2、BUB1B 和 BUB1（图5）。GO和KEGG功能富集分析得到关键基因主要富集于细胞周期调控，有丝分裂姐妹染色单体分离，同源重组修复等通路（图6）。

3 讨论

在多种癌症组织中发现癌细胞可表现出与干细胞特性相似的生物学功能，包括：（1）自我更新调节机制；（2）肿瘤细胞可能来源于正常干细胞[11]。并且有研究表明肿瘤组织中存在小部分具有无限增殖能力的肿瘤干细胞（CSCs）群体[12]。在概念上提出干细胞样癌细胞的数年后，学者首次在白血病模型中证实CD34+CD38-白血病细胞表现出骨髓造血干细胞特征[13]。同时实体瘤内的CSCs（CD44+CD24-/lowLineage-细胞）已在乳腺癌、脑、结肠、胰腺、肝和肺癌中发现。因此，CD34+,CD44+被认为是在癌症组织中独特的CSCs标记物[14]。

图3 关键模块的筛选

图4 蓝绿色模块中的差异基因筛选及基因间的相关性分析

图5 10个枢纽基因的筛选：44个关键基因的PPI图，及10个枢纽基因的PPI图

图6 GO和KEGG分析

本研究采用WGCNA筛选出的10个枢纽基因参与了多种肿瘤的发生，其功能主要富集在有丝分裂核分裂、核染色体分离、纺锤体检查点功能和同源重组修复通路中，这与多位学者的研究结果一致[15]。Mps1(TTK)的表达水平降低导致乳腺癌细胞的有丝分裂异常[16]。CDCA5和CDCA8表达异常影响了细胞核的分裂，主要参与膀胱癌的细胞周期过程[17]。Imai T等人的研究表明，KIF11在食管鳞状细胞癌(ESCC)和结直肠癌(CRC)组织中的CSCs里发挥着重要作用[18]。HuiCai等人的研究报道CCNB1通过调控细胞周期来影响子宫内膜癌的发病风险[19]，此外，在脑癌CSCs中，CCNB1和BUB1B可影响与有丝分裂和纺锤体检查点功能有关的蛋白分泌，从而调控CSCs的增殖[20]。然而，这10个枢纽基因与UCEC中CSCs的干性特征的关系尚未明确。本次研究发现，这些基因的失调可能与UCEC中CSCs的干性特征有关。

4 结论

CSCs位于肿瘤细胞层级的顶端，并具有建立和驱动肿瘤发生的独特能力。我们通过WGCNA分析获得了与UCEC干性特征相关的枢纽基因（即TTK、NCAPH、NCAPG、KIF15、KIF11、CDCA8、CCNB1、CCNA2、BUB1B 和 BUB1）。而这些基因在调节细胞周期中起着至关重要的作用，可能影响UCEC的干细胞维持。因此，我们的研究有助于深入理解UCEC的分子机制，我们获得的这10个枢纽基因可能为研究靶向治疗UCEC的治疗靶点提供参考。