DRD4/cAMP/PKA在酒精依赖大鼠海马区的表达情况

安子宜，董泽嵩，霍楠楠，李 齐，黄云蕾,韩智学，杨 勇，刘洪凤,3

(1.牡丹江医学院基础医学院，黑龙江 牡丹江 157011;2.中国人民解放军93220部队;3.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150000)

酒精依赖是一种慢性多因素脑疾病，具有无法控制饮酒的特征，是世界上潜在的公共卫生挑战之一[1]。目前，酒精依赖相关分子机制的研究尚不明确，Clay JM等人研究表明长期饮酒会导致多巴胺奖赏途径的神经适应和神经内分泌反应性的增加[2]。多巴胺D4受体(DRD4)是多巴胺D2类受体中的一个亚型，广泛分布于海马区，在酒精依赖中，记忆中心海马区对寻觅酒精行为的作用尤为重要[3];DRD4在调节海马区神经传递中起关键作用，其与配体结合后可调节cAMP的水平，cAMP/PKA的改变影响酒精依赖有关的行为反应，因此，DRD4介导的cAMP/PKA信号传导异常可能是产生酒精依赖的原因[4]。故本实验研究DRD4/cAMP/PKA途径在酒精依赖大鼠海马区的表达情况，进一步揭示酒精依赖相关的神经生物学机制，为治疗酒精依赖提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠16只，体重170～200 g，6周龄，购自辽宁长生生物技术有限公司[SCXK(辽)2015-0001]。于牡丹江医学院实验动物中心SPF级鼠类实验室进行动物模型的构建及检测。

1.1.2 试剂 总RNA提取试剂盒(北京 Solarbio公司);逆转录试剂盒(大连 Takara公司);TB Green® Premix Ex TaqTM(大连 Takara公司);引物(上海生工)。

1.1.3 仪器 高架十字迷宫(上海移数信息科技有限公司);BCN-1360B生物洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);NanoDrop 2000(美国 Thermo公司);S1000 Thermal Cycler PCR(美国 BIO-RAD公司);StepOne Real-Time PCR System(美国 Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 制备10%酒精依赖大鼠模型 将16只SPF级雄性SD大鼠单笼饲养，随机数字表法分为对照(A)组(n=8)和10%酒精依赖模型(B)组(n=8)。大鼠适应1周后制备模型。A组为双瓶100 mL蒸馏水，B组为一瓶100 mL蒸馏水和一瓶100 mL 10%酒精，每天记录大鼠的饮酒量(mL/24 h)、饮水量(mL/24 h)，每天更换水瓶和酒精瓶的位置、更新溶液，连续造模4周，28 d。两组每周更换垫料，检测大鼠体重。B组的酒精摄入量[g/(kg·24 h)]和酒精偏好逐渐稳定时，即成功制备SD大鼠酒精依赖模型[5];在最后一次饮酒24 h后，对A组和B组大鼠进行高架十字迷宫测试和戒断综合征评估，大鼠行为学改变进一步验证是否成功制备模型[6]。

1.2.2 高架十字迷宫 将16只大鼠置于温度恒定、光线恒定、昏暗的实验室，进行高架测试。十字高架位于地面上方50 cm处，由1对开口臂和1对闭合臂组成。点击测试系统，设置实验参数(总活动度、进臂次数等)完毕后，将大鼠置于“十”字中央，测试3 min，酒精棉球擦拭后，进行下一只大鼠测试。大鼠进入开放臂的次数越少，在开放臂的探索时间越短，则其焦虑程度越高[6]。

1.2.3 酒精戒断综合征评分(EWS) 据Motaghinejad M等[7]的方法，在模型组最后一次饮酒24 h后对两组大鼠进行评分，16只大鼠均在相同的环境下进行观测。观测项目包括刻板行为、激惹性、尾巴强直、异常姿势和听源性癫痫发作情况，该5项中每项包括5个评分(1分、2分、3分、4分、5分)，5个项目评分之和为总评分，评分越高说明戒断症状越严重。

1.2.4 大鼠海马区DRD4、AC、PKA、CREB mRNA表达水平检测 将大鼠麻醉后，颈椎脱臼处死，取出脑组织中的海马区备用，根据总RNA提取试剂盒说明书提取A组、B组大鼠海马区的总RNA，分别用移液枪吸取2 μL的总RNA，用仪器NanoDrop2000测定RNA的浓度和OD值，重复3次，取平均值;根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录样品配制，通过S1000 Thermal Cycler PCR进行逆转录;采用StepOne Real-Time PCR System qPCR检测DRD4、AC、PKA、CREB的mRNA表达水平，引物见表1。

表1 引物序列

反应体系：根据TB Green® Premix Ex TaqTM说明书配制20 μL反应液，包括TB GREEN 10 μL，上、下游引物(10 M)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50X)0.4 μL，cDNA 2 μL，灭菌水6.8 μL。

反应条件：预变性(95 ℃ 30 s);PCR反应(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环40次);Melt Curve(95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s)。

mRNA的表达水平以2-△△Ct表示，在Excel中计算出△Ct，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，再计算出2-△Ct，算出2-△Ct的平均值后，将每个2-△Ct除以2-△Ct的平均值，得出2-△△Ct。

1.3 统计学方法运用SPSS 23.0软件进行统计学处理，计量资料以“均数±标准差”表示，两组间比较采用t检验，多组组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异具有统计学意义，绘图运用Graphpad Prism 7.0。

2 结果

2.1 酒精依赖动物模型的建立

2.1.1 建模期间两组大鼠的体重变化 实验初始A组体重与B组体重比较差异没有显著性差异(P>0.05)，实验结束时A组体重与B组体重比较没有统计学意义差异(P>0.05)，见表2。

表2 两组SD大鼠的体重变化

2.1.2 建模期间10%酒精依赖模型组的酒精摄入量和酒精偏好 经过28 d循环连续饮酒，B组在最后7 d的酒精摄入量稳定在(7.11±0.36)g/(kg·24 h)，统计分析表明，B组在最后7 d饮酒的酒精摄入量无显著差异(F(6，49)=0.949，P>0.05);酒精偏好稳定在(57.30±1.86)%，统计分析在最后7 d饮酒的酒精偏好无显著差异(F(6，49)=1.860，P>0.05)，见表3。

表3 B组大鼠最后7 d饮酒的酒精摄入量和酒精偏好

2.2 高架十字迷宫测试比较各组行为学变化与A组大鼠比较，B组大鼠在B组最后一次饮酒24 h后，与A组大鼠比较，B组大鼠进入开放臂次数百分比、在开放臂滞留时间百分比明显减少，且具有统计学意义(P<0.001);然而，B组大鼠进臂总次数与A组大鼠进臂总次数比无显著差异(P>0.05);B组大鼠经过的总路程与A组大鼠经过的总路程比无显著差异(P>0.05),见表4。

表4 大鼠在高架十字迷宫中检测参数

2.3 酒精戒断评分评估大鼠的戒酒症状B组在饮酒期间较为温顺，不易激惹，很少出现攻击性行为。但在戒酒24 h的戒断评分明显升高(P<0.001)，见表5。

表5 酒精依赖大鼠戒断行为评分表

2.4 DRD4/cAMP/PKA途径在酒精依赖大鼠海马区的表达情况与A组相比，B组DRD4显著升高(P<0.001)，AC、PKA、CREB显著下降(P<0.01);B组中，与DRD4相比，AC明显下降(P<0.001)、PKA明显降低(P<0.0001)、CREB明显降低(P<0.001)，见图1。

图1 酒精依赖后海马中相关基因的mRNA相对表达情况

3 讨论

酒精依赖是世界上最复杂的物质成瘾之一，其涉及的相关问题严重影响人们的生存质量。Taraskina AE等对外周血淋巴细胞多巴胺受体进行评价时发现酒精依赖与DRD4的高表达有关，DRD4基因的表达水平改变了酒精依赖行为的神经适应过程[8];Muntean BS等通过光遗传学技术发现多巴胺触发的cAMP改变在程序奖励评估和成瘾药物中具有重要作用，多巴胺信号向cAMP的调制为上瘾状态中的调节作用提供了支撑[9]。

本研究结果显示，在酒精依赖大鼠海马区，DRD4 mRNA水平明显升高，AC、PKA、CREB的mRNA水平明显下降，DRD4在大脑中与情感、强化和动机相关的区域(如海马等)高度表达，可以通过AC降低cAMP水平，抑制神经元活动[10]，这表明DRD4可能通过调控cAMP/PKA通路在酒精依赖中发挥重要作用。与我们之前在比较10%双瓶连续饮酒模型和20%双瓶间歇饮酒模型的研究中得到的结论一致[11]，双瓶连续饮用10%酒精建立酒精依赖大鼠模型效果良好，能有效开展实验;酒精依赖时，大鼠海马区DRD4高表达，AC、PKA、CREB低表达，DRD4/cAMP/PKA可能在酒精依赖产生的神经适应性改变中发挥重要作用，这为酒精依赖相关的神经生物学机制的研究提供新思路。但本研究也存在一定的局限性：如:(1)通过免疫组化、western blot等分子生物学技术检测相关蛋白的表达会更好;(2)若进一步研究DRD4影响cAMP/PKA途径在酒精依赖大鼠海马区的表达情况可能会更好地证实DRD4介导的cAMP/PKA途径在酒精依赖发生中的机制。