小麦茎尖超低温保存处理条件的优化研究

刘梦倩　苏丽环　杨宝贞　闫洪波

摘    要：以普通小麦为材料，探讨保护液中不同DMSO浓度、蔗糖浓度及不同冷冻处理时间对超低温保存后小麦茎尖成活率的影响，以获得最优超低温保存方法。重点针对小麦在超低温保存时的各处理条件对小麦茎尖成活率的影响展开了试验。结果表明，当保护液中含16%浓度的DMSO和6%浓度的蔗糖，并将预处理后的小麦茎尖采用梯度降温法：0 ℃停留存放30 min、-7 ℃停留存放1 h、-20 ℃停留存放1 h、迅速转移放入-80 ℃冰箱停留存放1 h、迅速投入液氮中过夜的超低温保存条件达到最高成活率，从而确定了小麦茎尖超低温处理时保护液中的最佳浓度组合及低温处理的最佳时间。

关键词：小麦茎尖;超低温保存;处理条件;优化

文章编号： 1005-2690（2021）05-0011-02       中国图书分类号： S512.1       文献标志码： B

在现代社会中，随着人口不断增长，对粮食的需求也随之增大，小麦作为重要谷物来源之一，急需增加其年产量。但是近年来，随着小麦种植面积减少，如何利用有限的土地资源提升单位面积小麦的年产量，成为育种家所要面临的巨大难题。为了利用最完整的科学方法改进其生产特性，研究者投入了大量的精力和资金。除了传统的遗传方法外，生物技术方法也被广泛应用于新型小麦培育。

由于复杂和昂贵的生物技术而产生的细胞系体外保存是一个实际问题。然而，种质的长期培养需要对标本进行周期性的再培养，有可能由于感染、形态发生潜力的降低和体细胞无性系变异的出现导致标本丢失。

长期保存的植物材料集合在液氮温度（-196 ℃）允许损失价值的标本要避免和减少费用，因此，开发高效可靠的低温保存方法是目前最迫切的问题。

植物冷硬化[1]和糖溶液中的孵化[2]用于提高植物的耐寒性。此外，这些程序也被包括在低温保存方案中，以增加收集标本在液氮中冷冻前的冷冻抵抗能力。另外，植物材料的冷硬化还涉及在预培养阶段的处理，使用脱落酸（ABA）和非穿透性或穿透性低温保护剂，如二甲亚砜（DMSO）、乙二醇、甘油及其组合[3]。而一些低温保护剂，如DMSO，是有毒的，并显示诱变特性。即使经过冷硬化和蔗糖处理，体外培养的植物细胞、组织和器官也含有许多游离的未结合水分子。因此，有必要对冷冻前的标本进行脱水处理，也就是说，自由细胞游离水能够形成冰晶冻结，导致细胞损伤和死亡[4]。

植物材料的脱水有多种程序，可通过在可编程设备中缓慢冷冻过程中生长细胞外冰晶来脱水、玻璃化溶液中的脱水，以及无菌空气流或吸湿物质或其饱和溶液中的部分干燥。

小麦的超低温保存研究主要集中在将小麦种子投入液氮中进行超低温保存，以及幼苗生长、耐低温能力及抗老化能力的影响等方面。但是對于小麦茎尖的超低温保存研究报道较少，本试验尝试用超低温保存刚萌发出的小麦茎尖，找到用液氮超低温保存小麦幼苗的路线。

1   材料与方法

1.1   材料

试验所用小麦种子由河北省农林科学院提供。

1.2   种子消毒与培养方法

挑选大小均一、饱满整齐的小麦种子，用流动的自来水冲洗15 min;清洗后的种子用浓度为0.1%的升汞浸泡15 min，然后用无菌水浸泡洗涤3次，每次1 min;接着用浓度为75%的乙醇浸泡洗涤1 min，再用无菌水浸泡洗涤3 次，每次1 min;最终把种子转移到带有少许无菌水的无菌培养皿中，放入25 ℃培养箱培养，每个培养皿中大约放入 50粒种子。待小麦发芽第2天，切去小麦根部组织，留下茎尖部位。

1.3   小麦茎尖超低温处理流程

把小麦茎尖放入无菌的1.5 mL离心管中，加入由蔗糖和DMSO组成的冷冻保护剂，高浓度的蔗糖及DMSO对细胞具有毒性，而低浓度时对细胞的保护能力又不足，因此设置了5个DMSO浓度梯度来研究DMSO的保护效果，分别为6%、12%、16%、20%、24%，同时在控制DMSO某个浓度不变的情况下，设置了5个蔗糖浓度梯度来研究蔗糖浓度的保护效果，分别为0、3%、6%、9%、12%。然后进行梯度降温处理， 4 ℃ 3 h、0 ℃一段时间、-7 ℃ 1 h、-20 ℃ 1 h、 -80 ℃ 1 h，然后放入液氮中过夜。为研究0 ℃处理时间对超低温保存后成活率影响，设置了 0 min、15 min、30 min、45 min、60 min 这5个梯度。从液氮中取出材料，在40 ℃条件下快速解冻。

1.4   成活率的测定与统计方法

将解冻后的小麦茎尖中的保护剂吸出，并在无菌水中清洗两次，每次30 s，接着将小麦茎尖放到经过高压灭菌的滤纸上吸去残液，接种到不加激素的MS培养基上，25 ℃暗培养2 d后，转到正常光照条件下培养，15～20 d后统计茎尖成活个数（以出现绿色茎尖为成活标志）。根据成活个数与处理总数的比例来确定成活率[5]。上述试验设置3个平行样品，最终取其平均值。

2   结果与分析

2.1   保护液中不同DMSO浓度对成活率的影响

DMSO是超低温保存植物材料的常用保护剂之一。试验结果如表1所示，16% DMSO处理的小麦茎尖成活率最高，约为60.15%。由此可以得知，高浓度的DMSO对小麦茎尖的毒害作用很大，但是过低浓度的DMSO对小麦茎尖的保护作用又不明显，16%浓度的DMSO可以作为小麦茎尖的超低温冷冻保护剂浓度使用量。

2.2   预处理液中不同蔗糖浓度对成活率的影响

如图 1 所示，保护剂中没有蔗糖的成活率较低，仅为10.73%;蔗糖浓度在6%之前，茎尖成活率与浓度成正相关;蔗糖浓度在6%时，成活率达到最高值。蔗糖浓度在6%以上时，随着蔗糖浓度的升高，小麦茎尖成活率呈现下降趋势;当蔗糖浓度达到12%时，成活率降为32.62%，这是由于过高的蔗糖浓度形成的高渗透压可能对小麦茎尖造成伤害，导致小麦茎尖受到损伤，影响其成活率。

2.3   不同处理时间对小麦茎尖成活率的影响

在逐步降温的过程中，可以充分提取细胞内的水分，从而有效避免植物材料冷冻保存过程中形成细胞内冻结，达到良好的保存效果。据了解，滞留可诱导细胞内的溶液冻结，使细胞外产生蒸汽压差，并进行保护性脱水，否则，细胞外可能产生异质性冰晶，对细胞造成严重损害。如表2所示，将预冷处理的小麦茎尖0 ℃处理0 min、15 min、30 min、45 min、1 h，解冻后发现0 ℃处理30 min小麦茎尖的成活率最高。

综上所述，小麦茎尖保护剂中不同 DMSO 浓度、蔗糖浓度及低温处理时间都对小麦茎尖的超低温保存成活率有着显著影响。当保护剂中DMSO浓度为16%、蔗糖浓度为6%，并且在0 ℃处理30 min后，再经后续处理，最终接种到 MS培养基上，可使小麦茎尖在第15天达到最高成活率59.36%。

有研究表明，曾琳等[6]对降香黄檀种子进行超低温保存，得到解冻后种子的成活率为50.45%。王君晖等[7]用二步法对大麦幼穗进行试验，结果表明，解冻后的幼穗成活率达50%左右。孙龙华等[8]研究红豆草组织物的超低温处理，用此方法得到解冻后的组织成活率达66%。扁桃茎尖在4 ℃环境下随着低温处理时间的延长，其存活率不断提高，但低温处理时间超过28 d后，其存活率便不断降低;而未经过低温处理的扁桃茎尖进行超低温保存后的存活率为0。虽然后期生长需重新生根，但小麦茎尖的超低温保存也可成为一种种质保存途径。

参考文献：

[ 1 ] Salcheva，G.，Samygin，G.A..Microscopic observations of freezing of winter wheat tissues[J].Fiziol. Rast，1963（1）：65-72.

[ 2 ] Tumanov，I.I.，Krasavtsev，O.A.，Trunova，T.I..Survival of winter wheat at 196 ℃ as a result of vitrification[J].Dokl. Akad.Nauk SSSR，1965：978-981.

[ 3 ] Popov，A.S..Some mechanisms of plant cell cryodamage in vitro and characteristic of their cryopreservation[J].Fiziol. Rast.，1993（3）：485-496.

[ 4 ] Samygin，G.A..Prichiny vymerzaniya rastenii （Causes of Plant Winterkilling）[M].Moscow：Nauka，1974.

[ 5 ] 盧杰.微藻、草莓和小麦的超低温保存条件的建立与DNA直接转化探究[D].石家庄：河北经贸大学，2020.

[ 6 ] 曾琳，何明军，陈葵，等.降香黄檀种子和离体胚超低温保存研究[J].中国中药杂志，2014，39（12）：2263-2266.

[ 7 ] 王君晖，严庆丰，黄纯农.大麦幼穗的玻璃化法超低温保存及冻后植株再生[J].植物学报，1996（9）：730-734.

[ 8 ] 孙龙华，简令成.红豆草组织培养物的超低温保存及其超微结构的观察[J].Journal of Integrative Plant Biology，1990（4）：262-267，333-335.