FDFT1基因重组慢病毒表达载体的构建及其表达测定

陈晓颖，易雪丽，，陆飞燕，曾怡

(1. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院病原微生物学与免疫学教研室，广西 百色 533000)

法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl diphosphate farnesyl transferase 1，FDFT1) ，又称鲨烯合成酶，是一种分子量为47 kDa的酶，由416个氨基酸组成。人类FDFT1启动子包含两个固醇调节元件(sterol regulatory element，SRE)SRE-1基序、一个倒置的SRE-3 (inverse SRE-3，Inv SRE-3)和一个核转录因子Y(nuclear factor，NF-Y)，是SRE结合蛋白(binding protein，BP)SREBPs的结合位点。这三个SREBP结合位点已经被证实与甾醇介导的FDFT1启动子的调控有关[1]。SREBPs以转录因子形式参与胆固醇生物合成途径的许多基因的转录。SREBP2是FDFT1的关键转录因子之一。SREBP2位于内质网膜上，当SREBP2被激活后进入细胞核，与FDFT1启动子中的SRE区域结合，激活FDFT1进入转录过程。FDFT1是胆固醇合成途径的第一个酶，通过两阶段反应合成角鲨烯。两个焦磷酸法尼酯(farnesyl pyrophosphate，FPP)分子先聚合形成前角鲨烯二磷酸(pre-squalene diphosphate，PSDP)， PSDP再被NADPH还原，生成角鲨烯[2]，角鲨烯通过氧化、还原等多步骤转化为胆固醇。有研究结果表明胆固醇代谢异常与癌症的发生有关[3]，因此，与胆固醇代谢相关的酶和相关的生物分子被认为可能是抗肿瘤治疗的靶点[4]，靶向胆固醇代谢治疗方法备受重视。FDFT1在胆固醇合成调节中起重要作用，因在肺癌、髓系白血病、乳腺癌等肿瘤中高表达[5]而备受关注。本实验通过构建FDFT1基因重组慢病毒表达载体，为进一步探索FDFT1基因在肿瘤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2、pCDH-GFP质粒载体为南京医科大学卢春教授馈赠。PCR引物、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PCR试剂盒、DL 2，000 DNA Marker、 DL 10，000 DNA Marker、DL 15，000 DNA Marker、DNA切胶回收试剂盒、real-time PCR (qPCR)试剂盒为Takara生物公司(大连)产品；内切酶XbaⅠ、BamHⅠ购自NEB公司；……