Breg细胞与Treg细胞在免疫性血小板减少症患者外周血中的表达及临床意义*

郝立君，许 腾，李智伟，杨舒婷，刘红春

新疆维吾尔自治区人民医院临检中心，新疆乌鲁木齐 830001

免疫性血小板减少症(ITP)是临床上较为常见的出血性疾病，属于自身免疫性疾病，主要是由于自身抗血小板抗体导致血小板破坏增加和血小板生成受到抑制，临床主要表现为皮肤淤点、淤斑，严重者可出现内脏或颅内出血[1]。研究表明，ITP的发生与体液免疫及细胞免疫失调有关[2]，包括自身抗体、B细胞因子、辅助性T细胞(Th)、调节性T细胞(Treg细胞)[3]。B淋巴细胞可以产生血小板抗体，导致血小板破坏增多，同时免疫系统失衡使得相关细胞因子表达出现变化，进一步影响血小板的生成与释放[4]。目前，关于ITP的免疫调节机制尚不明了，本文通过流式细胞术研究ITP患者治疗前后调节性B细胞(Breg细胞)占CD19+细胞的百分比、Treg细胞占CD4+细胞的百分比的变化及与白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的相关性，进一步探讨以上指标在ITP发病中的免疫调节机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年3月至2019年12月本院血液病科收治的初诊患有ITP的住院患者35例为研究对象。35例ITP患者中男性24例，女性11例；年龄25～77岁，年龄中位数(四分位数)[M(P25，P75)]为42(38,62)岁。ITP的临床诊断符合《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》[1]的评分要求，治疗前PLT<30×109/L(ITP治疗前组)，治疗后PLT>50×109/L(ITP治疗后组)。选取同期体检健康者40例作为健康对照组，男性26例，女性14例；年龄24～71岁，年龄38(30,48)岁。ITP患者与体检健康者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：临床初诊ITP患者；患者自愿参与本试验并由本人或监护人签署知情同意书。排除标准：(1)近1个月内接受过激素、丙种球蛋白、甲状腺过氧化物酶、免疫抑制剂、化疗药物、血小板生成素受体激动剂等治疗；(2)合并血小板降低等其他疾病，如感染、系统性红斑狼疮等免疫类疾病，血液或其他系统恶性肿瘤；(3)入院时已输注血小板进行血象纠正。

1.2仪器与试剂 淋巴细胞分离液(Ficoll)购自美国GE公司；CD38 FITC(333173，HB7)、CD24 APC(656150， ML5)、CD45 PerCP(340385，X40)、CD19 PE(349209，4G7)；CD4 FITC(340039，SK3)、CD127 PE(552543，SB/119)、CD3 PerCP(340298，SK3)、CD25 APC(340938，2A3)流式抗体购自美国BD公司；细胞因子IL-10和TNF-α检测使用北京旷博公司AimPlex 流式高通量多因子检测试剂盒及美国BD公司FACS Canto Plus流式细胞仪。

1.3方法

1.3.1血样采集 分别采集体检健康者和ITP患者治疗前后外周静脉血(空腹)两管，其中一管采用乙二胺四乙酸(EDTA)进行抗凝，采集6 mL用于分离外周血单个核细胞(PBMC)；另一管使用无添加剂采血管采集3 mL离心后取血清转入EP管，放置于-80 ℃冻存用于IL-10、TNF-α水平检测。

1.3.2分离PBMC 将6 mL外周血与磷酸缓冲盐溶液(PBS)按1∶1的比例稀释混匀。取6 mL Ficoll于50 mL离心管中，倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll上方1 cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。18～20 ℃、2 000 r/min离心30 min后轻轻吸出单个细胞层放入新的离心管中。加入3倍于PBMC体积的PBS，2 000 r/min 离心30 min，重复2次。弃上清液制备成PBMC细胞悬液。

1.3.3流式细胞术检测Breg细胞和Treg细胞 Breg细胞检测管吸取100 μL全血，然后加入CD38 FITC 20 μL、CD19 PE 20 μL、CD45 PerCP 20 μL、CD24 APC 5 μL。Treg细胞检测管吸取100 μL全血，然后加入CD4 FITC 20 μL、CD127 PE 20 μL、CD3 PerCP 20 μL，CD25 APC 5 μL。将检测管避光放置15 min后加入2 mL红细胞裂解液，溶血10 min后离心去上清液，再加入2 mL PBS洗涤离心去上清液，加入500 μL PBS，重悬。使用美国BD公司FACS Canto Plus流式细胞仪进行检测，检测数据使用FlowJo 10.5进行数据分析，计算Breg细胞占CD19+细胞的百分比和Treg细胞占CD4+细胞的百分比。

1.3.4流式Aimplex法检测细胞因子IL-10和TNF-α水平 (1)标准品为冻干粉(使用前约4 300 r/min离心10 s)，加入250 μL标准品稀释液，混匀冰浴5 min，取8联管(标记1～8)，每管加入120 μL标准品稀释液，取60 μL标准品原液加入8号管并混匀，由8号管依次转移60 μL到上一管混匀，直至2号管，1号管加标准品稀释液作为本底，完成梯度稀释。(2)从冰箱中取出样品复融。(3)加入样品或标准品，每孔45 μL，封板并避光室温震荡60 min。(4)用抽滤器抽掉孔内液体，每孔加入100 μL洗液洗3次。(5)加入Biotin-dAb(二抗)，每孔25 μL，封板并避光室温震荡30 min。(6)用抽滤器抽掉孔内液体，每孔加入100 μL洗液洗3次。(7)加入藻红蛋白标记的链霉亲和素，每孔25 μL，封板并避光室温震荡20 min。(8)用抽滤器抽掉孔内液体，每孔加入100 μL洗液洗3次。(9)加入读数液，每孔150 μL，备用。(10)取剩余微球加入400 μL 读数液混匀倒入流式管，上机调门框。(11)吹吸各孔内液体使孔内微球悬浮，转入流式管上机进行检测。

2 结 果

2.1ITP治疗前组、ITP治疗后组及健康对照组Breg细胞占CD19+细胞的百分比和Treg细胞占CD4+细胞的百分比比较 与健康对照组比较，ITP治疗前组Breg细胞占CD19+细胞的百分比显著降低，Treg细胞占CD4+细胞的百分比也显著降低，差异有统计学意义(t=3.855、5.730，均P<0.01)。与健康对照组比较，ITP治疗后组Breg细胞占CD19+细胞的百分比显著降低，Treg细胞占CD4+细胞的百分比也显著降低，差异有统计学意义(t=2.186、2.037，均P<0.05)。与ITP治疗前组比较，ITP治疗后组的Breg细胞占CD19+细胞的百分比显著升高，Treg细胞占CD4+细胞的百分比也显著升高，差异有统计学意义(t=2.859、5.730，均P<0.01)。见表1和图1～2。

2.2ITP治疗前组、ITP治疗后组及健康对照组外周血IL-10、TNF-α水平比较 与健康对照组比较，ITP治疗前组外周血IL-10水平显著降低，而TNF-α水平显著升高，差异有统计学意义(t=6.551、23.90均，P<0.01)。与健康对照组比较，ITP治疗后组外周血IL-10水平显著降低，而TNF-α水平显著升高，差异有统计学意义(t=2.428、15.62，均P<0.01)。与ITP治疗前组比较，ITP治疗后组外周血IL-10水平显著升高，而TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义(t=8.463、12.18，均P<0.01)。见表2。

表1 ITP治疗前组、ITP治疗后组及健康对照组Breg占CD19+细胞的百分比和Treg细胞占CD4+细胞的百分比比较

表2 ITP治疗前组、ITP治疗后组及健康对照组外周血IL-10、TNF-α水平比较

注：A表示ITP治疗前组；B表示ITP治疗后组；C表示健康对照组。

2.3外周血Breg细胞占CD19+细胞的百分比、Treg细胞占CD4+细胞的百分比、IL-10、TNF-α水平的相关性分析 外周血Breg细胞占CD19+细胞的百分比与外周血IL-10水平呈正相关(r=0.763 2，P<0.01)，与TNF-α水平呈负相关(r=-0.647 1，P<0.01)，与外周血Treg细胞占CD4+细胞的百分比呈正相关(r=0.691 7，P<0.01)。见图3。

注：A表示ITP治疗前组；B表示ITP治疗后组；C表示健康对照组。

注：A表示Breg细胞占CD19+细胞的百分比与IL-10水平的相关性；B表示Breg细胞占CD19+细胞的百分比与TNF-α水平的相关性；C表示Breg细胞占CD19+细胞的百分比与Treg细胞占CD4+细胞的百分比的相关性。

3 讨 论

一般认为ITP发病机制为患者体内产生自身抗血小板抗体，使血小板破坏增多或生成受到抑制。机体免疫状态失衡是导致ITP进展的关键因素，众多免疫细胞参与其中[5-6]。目前对于ITP的免疫相关研究主要集中于Breg与Treg这两种调节性细胞[7]。Breg细胞在免疫相关性疾病中对B细胞具有负向免疫调节作用，B细胞在多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、皮肌炎等自身免疫性疾病的发病机制中起重要作用，ITP患者血液中B细胞增殖、分化产生抗体导致血小板破坏增加[8-9]。Breg细胞存在于脾脏中，在B细胞中占比不足1%，具有免疫调节特性[5]，并通过分泌IL-10和转化生长因子β(TGF-β)发挥免疫调节作用[6]，如果Breg细胞功能减弱或缺失可能引起多种自身免疫性疾病[10]。本研究结果提示，ITP治疗前组外周血Breg细胞占CD19+细胞的百分比较健康对照组降低，ITP治疗后组外周血Breg细胞占CD19+细胞百分比较ITP治疗前组升高，ITP治疗后组外周血IL-10水平虽低于健康对照组但显著高于ITP治疗前组，且与Breg细胞占CD19+细胞的百分比呈正相关，提示在ITP疾病中Breg细胞通过分泌IL-10发挥免疫调节作用，抑制免疫反应，延缓甚至改善ITP疾病进展。这与朱世荣等[11]报道的Breg细胞作用于相应的靶向T细胞，通过分泌IL-10发挥免疫抑制作用抑制自身免疫发生的结论一致。

Breg细胞可促进CD4+CD25-T细胞转化为Treg细胞[12]，本研究中外周血Breg细胞占CD19+细胞的百分比与Treg细胞占CD4+细胞的百分比呈正相关，Breg细胞占CD19+细胞的百分比与IL-10水平亦呈正相关。Breg细胞是IL-10的主要来源，同时可以抑制T细胞增殖并诱导Treg细胞[13-14]，因此，考虑Breg细胞所分泌的IL-10对Treg细胞的生成和维持起重要作用。Treg细胞是一群具有免疫抑制特性的细胞，受Breg细胞调控的同时自身又可分泌IL-10及TGF-β，发挥免疫抑制功能[15]。有研究表明，可能Treg细胞生成减少导致CD4+细胞活化增强，使得IL-2与γ干扰素等细胞因子升高，从而使T淋巴细胞释放穿孔素杀伤血小板自身抗原，并且能增强单核细胞的吞噬作用，致使血小板破坏增加[11]。本研究数据显示，ITP治疗后组外周血Treg细胞占CD4+细胞的百分比略低于健康对照组，但显著高于ITP治疗前组，因此，恢复Treg细胞功能在治疗ITP患者的过程中尤为重要。

TNF-α作为Th1细胞主要分泌的细胞因子类型，在感染性休克、肾移植排斥反应、弥散性血管内凝血、系统性红斑狼疮等疾病中起重要作用，在恶性肿瘤发生时能够一定程度上抑制或杀死肿瘤细胞，但长期表达又可导致肿瘤细胞的恶化[16-17]。IL-10可抑制CD4+T细胞的活化及Th0细胞向Th1和Th2细胞的分化，从而使得TNF-α及IL-4等细胞因子减少，并且诱导效应T细胞的凋亡及调节Th1/Th2平衡，从而抑制自身免疫的发生[11]。本研究中，外周血Breg细胞占CD19+细胞的百分比与TNF-α水平呈负相关，ITP治疗后组TNF-α水平虽较健康对照组显著升高(P<0.05)，但相对于ITP治疗前组显著降低，提示ITP患者体内的T细胞免疫功能紊乱，甚至受到破坏，而该项目能否作为预后判断指标尚待进一步研究。ITP患者体内同时存在Th1/Th2免疫失衡，但对于是哪一种免疫反应处于主导地位仍存在争议[18-19]，如果能够明确其转化机制并进行干预将有助于疾病的治疗。目前对于ITP的主要治疗药物是糖皮质激素、静脉注射人免疫球蛋白、利妥昔单抗[19]，通过本研究可以推测，细胞因子治疗方法能够为ITP治疗提供新的思路。

综上所述，外周血Breg细胞与Treg细胞在ITP的发生、发展过程中起着重要作用，能通过分泌IL-10等细胞因子抑制T细胞及B细胞活性，Breg细胞又可诱导Treg细胞共同参与ITP患者体内免疫抑制，降低机体自身免疫功能。TNF-α又被IL-10的水平所影响，从而影响疾病进程，有助于临床诊疗。ITP属于免疫缺陷性疾病，研究其免疫调节机制，对于疾病靶向药物的研制及临床治疗至关重要，同时也为其他自身免疫性疾病的研究奠定了基础。