脑小血管病性认知障碍与外周血血浆外泌体浓度的相关性

孙文强,尹昌浩,刘 平,谭 琳,贺梦菲,赵维纳,4

(1.牡丹江医学院;2.牡丹江医学院附属红旗医院神经内科,黑龙江 牡丹江 157011;3.南方医科大学南方医院健康管理科,广东 广州 510515;4.黑龙江省缺血性卒中重点实验室,黑龙江 牡丹江 157011)

随着我国人口老龄化的进展,血管性认知障碍的发生发展得到了广泛的关注。脑小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)是血管性认知障碍的主要原因,CSVD性认知障碍起病隐匿,逐渐发展成痴呆,占各类型痴呆综述的45%,给社会和家庭带来沉重的负担[1]。外泌体是一种体内多种细胞分泌的膜性小囊泡,神经元性外泌体可自由穿过血脑屏障,并且稳定的存在于血液中[2-3],在血液中检测可反应脑部的病理改变,因此外泌体在认知障碍的发生与发展中具有很大的研究价值。外泌体作为细胞和组织信号传递的载体,在介导细胞通讯的过程中承担着miRNA转移的作用[2]。对于miRNA是否以外泌体作为载体从而介导CSVD性认知障碍的形成,目前尚无报道,且尚无证据表明差异表达的miRNA的差异量是否与外泌体的浓度有关。本研究拟通过提取、验证CSVD性认知障碍患者与健康对照人群的外周血中外泌体并检测其浓度,比较两组间的外泌体浓度差异,探讨血浆外泌体是否在CSVD性认知障碍患者发病机制中起作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2019年5月至2020年2月于牡丹江医学院附属红旗医院神经内科住院或门诊诊断为CSVD性认知障碍患者30例为观察组,另选取健康志愿者30例为对照组。观察组男13例,女17例;年龄53～75岁,平均(63.90±8.33)岁,平均受教育年限(9.80±2.74)年;对照组男15例,女15例,年龄54～68岁,平均(60.67±5.86)岁,平均受教育年限(10.50±1.52)年。两组高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、饮酒情况等基础资料差异无统计学意义(P>0.05) 。本研究经本院伦理委员会批准,与患者签署知情同意书。

1.2 CSVD性认知障碍诊断标准及纳排标准

1.2.1 CSVD性认知障碍诊断标准 依据 2019 年中华医学会老年医学分会老年神经病学组《脑小血管病相关认知功能障碍中国诊疗指南》推荐诊断为脑小血管病认知损害的诊断标准：(1)证实存在有认知功能障碍;(2)证实存在有脑小血管病;(3)确定脑小血管病是引起认知功能障碍的主要因素,并除外其他疾病所致的认知功能损害。

1.2.2 CSVD性认知障碍纳入和排除标准 纳入标准：(1)符合《脑小血管病相关认知功能障碍中国诊疗指南》CSVD性认知障碍诊断标准;(2)简易智力状态检查量表(MMSE)评估总体认知功能,得分小学组<21分,中学组和大学组<24分;蒙特利尔认知量表(MoCA)评分<26分,如果患者受教育年限≤12 年则在测试结果上加上1 分;(3)患者既往无痴呆病史,临床痴呆量表(CDR)<1分;(4)患者病情稳定。排除标准：(1)3个月内有急性脑血管疾病史,Hachiski缺血量表>4分;(2)原有严重心脏病者,包括：充血性心力衰竭、不能控制的心律失常等;(3)原有影响血脂代谢的疾病;(4)有重度抑郁,双向障碍,精神分裂症等精神疾病病史;(5)颅脑MRI或CT检查,除外颅脑占位及感染 、正压性脑水、脑肿瘤、进行性核上性麻痹、硬膜下血肿、帕金森病等。(6)除外造成神经系统损伤的脑外伤及其他脑结构异常等;(7)除外其他可引起认知下降的系统性疾病。

1.3 神经心理学评估采用蒙特利尔认知评估量表(MoCA) 评价两组认知功能,包括注意(3分) 、语言(5分) 、执行(3分) 、记忆(6分) 、视结构技能(4分) 、计算力(3分) 和地点定向力(6分) ,评分0～30分,分值越高,患者认知功能越良好。

1.4 外泌体提取及鉴定

1.4.1 血浆的分离 清晨6～8点采集所有受试者空腹静脉血10 mL,在4 ℃,2500 r离心10 min,取上清液即为血浆,冻存于-80 ℃,以上过程在2 h内完成。

1.4.2 血浆外泌体的提取 采用ExoQuick试剂盒法提取血浆外泌体,将血浆样品转移至离心管中,于4 ℃以3000 g离心10 min,去除样品中的细胞碎片。去除细胞碎片的上清液转移至新离心管,于4 ℃以10000 g离心20 min,去除样品中杂质,将离心后的上清液转移至新离心管中。在0.5 mL去除杂质的离心上清液中加入2.5 mL BIS试剂,使用涡旋振荡器震荡离心管1 min使溶液充分混合,再放置2 ℃～8 ℃ 静置2 h。取出装有混合液的离心管于4 ℃以10000 g离心60 min,弃去上清液。取50 μL 1×PBS缓冲液均匀吹打离心沉淀物,待其均匀分布在PBS中,然后转移到新的1.5 mL离心管中。将离心管于4 ℃以12000 g离心2 min,留取上清液冻存于-80 ℃冰箱。

1.4.3 外泌体透射电镜 从-80 ℃冰箱取出冻存的血浆外泌体,解冻后用1×PBS溶液适当稀释。使用移液器吸取10 μL稀释后的外泌体滴至200目铜网上,室温下处理20 min,将外泌体处理过的铜网转移至20 μL的1×PBS溶液中固定,重复两次。用4%戊二醛固定20 min,滤纸吸干并用1×PBS洗涤,置于室温下晾干,于透射电镜下观察,80 KV电压下成像。

1.4.4 外泌体粒径分析 经过Exoquick试剂盒提取得到的外泌体取50 μL加950 μL 1xPBS进行1∶20稀释,使用0.22 μm 滤膜过滤外泌体稀释液。过滤后的外泌体悬液直接使用纳米粒度颗粒跟踪分析仪(NanoSight NS 300)进行粒径检测,使用软件NTA3.2Dev Build 3.2.16进行分析。NanoSight NS 300配备sCMOS相机进行拍摄,激光类型为Blue488,快门317,增益15。每个样本重复3次。

1.4.5 外泌体总蛋白提取 实验前将裂解液2～8 ℃融化混匀后置于冰上,将外泌体样本与裂解液按体积比1∶1混匀后置于冰上裂解10 min,于4 ℃以12000 g离心5 min,将上清液装入离心管中置于-80 ℃冰箱备用。

1.4.6 外泌体浓度测定 计算BCA工作液总体积,定量取溶液A∶溶液B=50∶1,混匀,制成BCA工作液。取一定量的BSA标准溶液,用1×PBS溶液稀释为500 μg/mL。将待测样品用去离子水稀释10倍使其浓度尽量介于0～2.0 mg/mL之间。将200 μL工作液和10 μL稀释样品或标准品依次加入96孔内,每孔设一复孔,于37℃孵育15 min,使用酶标仪在570 nm波长下测定样品和标准品的吸光度值,参照标准曲线,读取样品的蛋白浓度。

1.5 统计学方法应用SPSS(Version 25.0)软件进行相关统计学分析,两组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆中外泌体的形态60例血浆样本中均成功分离出外泌体,透射电镜下可观察到直径在30～100 nm之间的外泌体囊泡状结构,呈典型的圆盘状形态(图1),验证为外泌体形态。

2.2 血浆外泌体粒径分析电镜验证为外泌体形态后,进一步进行粒径分析,结果显示所得粒径大小100 nm左右,浓度为(1.92×1010±2.12×109/mL),均符合外泌体的特征,进一步验证为外泌体。

2.3 两组认知功能评分比较观察组 MoCA 总评分及注意、语言、执行、记忆、计算力、定向力、视结构技能评分均显著低于健康组,差异有统计学意义 (P<0.05)(表1)。

图1 透射电镜下外泌体形态

表1 两组MoCA评分比较分)

2.4 两组间血浆外泌体浓度比较CSVD性认知障碍患者与正常对照血浆外泌体浓度分别为(4.62±1.37)mg/L、(5.83±1.77)mg/L,两组比较差异显著(P<0.05)(图2)。

图2 两组外泌体中总蛋白的表达量

3 讨论

血管性认知障碍是老年人中发病率较高的进展性认知障碍,起病比较隐秘,疾病初期局灶性症状较轻,进而发生痴呆,严重危害患者的身心健康[4]。脑小血管病是血管性痴呆最常见的病因,除了大血管病变的卒中能够导致认知水平下降外,CSVD亦是导致早期认知水平下降的重要原因[5];外泌体内容物与血管性认知障碍密切相关。Prabhakar等[6]研究表明血浆miR-409-3p、miR-502-3p、miR-486-5p和miR-451a可用于区分小血管性血管性痴呆与健康对照。血浆神经元性外泌体中的特定的突触蛋白水平随着AD的进展而下降,可以作为临床前AD认知障碍的生物标志物[7]。血管性认知障碍患者血浆外泌体中miR-29c表达水平升高,提示miR-29c与认知功能障碍相关[8]。但是血浆外泌体在CSVD性认知障碍中的作用机制尚不清楚。

本文利用电镜技术和粒径分析方法对外泌体形态及大小进行了验证,结果得到了具有特征的圆盘状外泌体结构。既往的研究多集中在脑脊液中的外泌体,本研究通过分离血浆中外泌体的方法,来探索CSVD性认知障碍患者与正常对照之间的外泌体浓度的的改变,结果显示CSVD性认知障碍患者血浆中外泌体浓度低于正常对照,提示血浆外泌体与CSVD性认知障碍相关;CSVD性认知障碍降低了患者注意、集中、语言、记忆和空间想象等认知能力,致使认知功能损伤。由于NPTX2和NRXNSα、AMPA4和NLGN1等蛋白与兴奋性突触活动相关,研究者通过对于这两对专门的突触蛋白的血浆外泌体水平进行定量检测以评估其生物标志物特征,结果显示这些特异性兴奋性突触蛋白的血浆外泌体水平的降低可以指示认知丧失的程度[7]。轻度认知障碍患者血浆外泌体中的Aβ1-42浓度显著增加,而神经颗粒素(Ng)、突触素、突触结合蛋白浓度显著降低[9]。本研究与上述研究结果一致,显示外泌体内容物与CSVD性认知障碍患者发病机制有关,并成为其可能的生物标志物。本研究对两组患者的MoCA评分进行了比较,显示CSVD性认知障碍组的总体评分较对照组低。CSVD引起的认知功能障碍主要影响执行力和注意力功能,而对记忆功能损害较轻,但在本研究中发现所有的认知域均发生了改变,可能是由于样本量较小导致。CSVD尤其是影像学类型表现为多发性腔隙灶及白质疏松的患者更易并发认知功能障碍[10]。多发腔隙性脑梗死患者梗死体积及梗死数量越多,认知功能障碍越严重,主要表现在颞叶、顶叶及额叶明显[11]。一项中国城市社区为期7年的纵向研究显示,白质高信号与脑小血管疾病的进展和执行功能的下降有关[12]。

综上所述,本研究结果提示CSVD性认知障碍患者血浆外泌体浓度有所改变,先前已有研究证实了血浆外泌体在血管性认知障碍中的作用,进一步证实了血浆外泌体在CSVD性认知障碍患者中的研究价值,为研究CSVD性认知障碍的发生机制提供思路。但是血浆外泌体内容物较多,micRNA、神经颗粒素、突触素、突触结合蛋白等均会以不同的机制影响CSVD患者的认知情况,需要进一步扩大样本量并且聚焦与发病有关的因子。