气相色谱-质谱法分析乳制品中的三种乳化剂

罗 芸, 鄢爱平, 刘 翻, 万益群*,

(1.南昌大学化学学院，江西南昌 330031；2.江西省现代分析科学重点实验室，南昌大学分析测试中心，江西南昌 330031)

食品乳化剂属于表面活性剂，能使油与水“互溶”，广泛用于面包、糕点、饼干、人造奶油、冰淇淋、饮料、乳制品、巧克力等食品的加工中[1]。乳制品是人类膳食结构中营养成分较高的食物之一，在其加工过程中往往会加入一定量的乳化剂以稳定其品质[2 - 4]。

目前，国内外对乳制品中的乳化剂的研究主要集中在乳化剂乳化性能、复配型乳化剂配比对乳制品品质的影响等方面[5 - 9]。马永轩等[7]研究了蔗糖脂肪酸酯乳化剂对谷物饮品的稳定性的影响，通过计算离心沉淀率探究了蔗糖脂肪酸酯和蔗糖单硬脂肪酸酯的复配比对产品品质的影响，同时发现添加蔗糖和三聚磷酸钠可以改善体系的稳定性。梁克中等[8]研究发现复配乳化剂比单一乳化剂对改善食品的稳定性有更好的效果。而乳制品中乳化剂含量检测的研究报道相对较少。乳制品中乳化剂的检测方法主要包括气相色谱和液相色谱。姜瑞清等[10]采用气相色谱-氢火焰离子化检测技术，建立了一种液态奶中单硬脂酸甘油酯的含量分析方法。 Fagan等[11]建立了一种基于固相萃取的气相色谱-质谱分析方法，并用于牛奶和乳制品成分中单酰基甘油(MAG)和二酰甘油(DAG)的测定，前处理使用Bligh和Dyer方法提取牛奶脂质，固相萃取逐步洗脱分离单甘酯和双甘酯，样品前处理过程相对较为复杂。由于乳制品加工过程中所添加的乳化剂量的多少对其品质的稳定性及安全性有影响，因此，研究建立乳制品中乳化剂快速、简便分析新技术具有一定的现实意义。

本文采用简便的液-液萃取方法，结合气相色谱-质谱联用技术，构建了一种乳制品中多种单甘酯乳化剂的分析新方法，并应用于实际样品的检测，取得了较好的结果，为乳制品品质监管提供了一种新的手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪(美国，Agilent公司)，包括7080B色谱系统、5977MSD和NIST图谱检索库；MD200-2氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)；MS2迷你振荡器(广州仪科实验技术有限公司)；TG20.5高速离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)；MILLI-QS超纯水器(美国，Millipore公司)。

单棕榈酸甘油酯(1-Palmitoyl-rac-glycerol)、单油酸甘油酯(1-Oleoyl-rac-glycerol)标准品均购自TRC公司(Toronto Research Chemicals )；单硬脂酸甘油酯(Glyceryl monostearate)标准品购自Aladdin公司；硅烷化试剂N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)(BSTFA+1%TMCS)购自Sigma公司；二氯甲烷为色谱纯，购自安徽天地高纯溶剂有限公司；吡啶和正庚烷均购自Aladdin公司。

1.2 色谱及质谱条件

色谱条件：色谱柱为HP-5MS毛细管柱；升温程序：初始温度为60 ℃，以30 ℃/min升至270 ℃，3 ℃/min升至285 ℃；载气：高纯氦气；流速：1.0 mL/min；进样量：1.0 μL；分流比：10∶1；进样口温度：250 ℃。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；溶剂延迟：6.5 min；采集方式：选择离子模式(SIM)扫描。三种目标物质质谱检测参数如表1所示。

表1 目标化合物相关质谱参数

1.3 样品前处理

准确移取0.5 mL左右牛奶样品，加入5.0 mL水并混匀，再加入10.0 mL二氯甲烷进行萃取，振荡10 min。13 000 r/min离心分离10 min，收集下层有机相。再用10.0 mL二氯甲烷重复上述萃取步骤，合并有机相。取1.0 mL萃取液用氮气吹干，加入50 μL吡啶溶解，再加入100 μL BSTFA+1%TMCS衍生化试剂，于70 ℃下反应40 min，并用正庚烷定容至1.0 mL，待测。

2 结果与讨论

图1 单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯SIM色谱图Fig.1 SIM chromatogram of glyceryl monopalmitate,glyceryl monooleate and glyceryl monostearate1:Glyceryl monopalmitate(100 mg/L);2:Glyceryl monooleate(100 mg/L);3:Glyceryl monostearate(100 mg/L).

2.1 色谱分离及质谱检测条件的选择

为使衍生化后的三种单甘酯乳化剂能较好地分离检测，对色谱分离条件(包括进样口温度、色谱柱类型和程序升温等条件)及质谱检测条件进行了优化，最终选择“1.2”的色谱分离及质谱分析条件。在优化的条件下，三种目标物在11 min内得到了较好分离，色谱图见图1。

2.2 衍生化条件的优化

本研究选择BSTFA+1%TMCS为衍生化试剂，取0.2 mL的混合标准溶液，衍生反应时间固定为1 h，考察了衍生试剂的用量分别为50、100、150、200、250、300 μL对目标物衍生效果的影响，结果见图2(a)。结果表明，当衍生试剂用量为100 μL时，三种目标物响应值达到最大，最终选择衍生试剂用量为100 μL。衍生时间对衍生化反应具有较大影响，实验考察了10～60 min范围内衍生时间对目标物衍生化效果的影响。如图2(b)所示，随着衍生反应时间的增加，目标物响应值增大并在40 min时达到最大。因此，衍生时间选择40 min。

图2 衍生试剂用量(a)和衍生时间(b)对单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯衍生效果的影响Fig.2 Effect of the amount of derivatization reagent(a) and derivatization time(b) on the derivatization of glyceryl monopalmitate,glyceryl monooleate and glyceryl monostearate1:Glyceryl monopalmitate(100 mg/L);2:Glyceryl monooleate(100 mg/L);3:Glyceryl monostearate(100 mg/L).

2.3 样品提取条件的选择

根据目标分析物及乳制品样品的特性，本实验选用二氯甲烷为溶剂提取乳制品中目标物，并考察了提取方式、提取溶剂用量以及提取时间对目标物提取效率的影响。结果表明，采用二次提取比一次提取效果更好。在蒙牛纯牛奶样品中添加一定量的单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯和单油酸甘油酯，研究不同用量二氯甲烷对目标物的提取效果，结果见图3(a)。每次用10 mL的二氯甲烷进行提取，分两次提取，即可达到完全提取的效果。

改变提取时间，考察了对目标物提取效率的影响，结果见图3(b)。随着提取时间增加目标物提取效率增大，在10 min时达到最大，而后延长提取时间，目标物回收率反而有所下降，究其原因可能是随着振荡提取时间的延长，目标物产生了一定水解。因此，本实验选择提取时间为10 min。

图3 CH2Cl2的用量(a)和提取时间(b)对单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯提取效果的影响Fig.3 Effect of the dosage of CH2Cl2(a) and extraction time(b) on the extraction efficiency of glyceryl monopalmitate,glyceryl monooleate and glyceryl monostearateSample 0.5 mL;1:Glyceryl monopalmitate(2 mg/L);2:Glyceryl monooleate(20 mg/L);3:Glyceryl monostearate(20 mg/L)).

2.4 线性方程及检出限

为消除样品基质对分析结果的影响，本实验采用基质配制标准溶液，以乳制品的二氯甲烷提取液为溶剂，配制一系列不同浓度的单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯混合标准工作溶液，在优化的衍生化条件下进行衍生，并在选择的色谱及质谱条件下进行分析，以峰面积(y)对分析物浓度(x)进行线性回归，得到线性回归方程，结果见表2。单棕榈酸甘油酯(1～20 mg/L)、单油酸甘油酯(5～100 mg/L)和单硬脂酸甘油酯(10～200 mg/L)线性关系良好(R2>0.992)。三种目标分析物检出限和定量限分别在0.262～1.203 mg/L和0.873～4.010 mg/L范围内。

表2 单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酸和单硬脂酸甘油酯的线性方程、检出限及定量限

2.5 回收率与精密度

选择市售酸牛奶和纯牛奶样品，分别添加三个不同浓度水平的混合标准单甘酯溶液，进行加标回收率实验，每个水平平行测定6次，结果见表3。三个目标物的加标回收率在63.5%～111.7%之间，相对标准偏差(RSD,n=6)小于3.0%。表明本方法具有较好的准确性和精密度，可以用于实际样品的测试。

表3 乳制品中单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯加标回收结果(n=6)

2.6 样品测定

从本地超市购买了6种不同品牌的乳制品样品，应用所建立的方法进行测试，结果见表4。所有样品中均检测到了单棕榈酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯，未检测到单油酸甘油酯。其中单棕榈酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯浓度范围分别为29.2～85.4 mg/L和395.8～843.7 mg/L。

表4 实际样品测定结果(n=3)

3 结论

本文以二氯甲烷为提取溶剂，BSTFA+1%TMCS为衍生化试剂，结合气相色谱-质谱联用技术，建立了一种乳制品中单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯和单硬脂酸甘油酯同时分析新方法。在优化的提取和衍生化条件下，样品的加标回收率在63.5%～111.7%范围内，RSD小于3%。该方法简单、快速，且具有较好的准确性，可适用于乳制品中单甘酯乳化剂的定性及定量分析。