分散固相萃取结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定火锅底料中5种罂粟壳生物碱

吴 琼，扈明洁，江 海，励 炯，邱红钰，李 玮

(杭州市食品药品检验研究院，浙江杭州 310017)

罂粟壳为罂粟科植物罂粟(PapavcrsominiferumL.)割取浆汁后的干燥成熟果壳，主要含有吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁五种生物碱[1]。食用这些含有生物碱的食品会使人嗜睡和性格改变，并造成食用者在心理、生理上产生强烈的依赖性，而长期食用则会危害人的神经系统和消化系统[2]。目前，检测火锅底料中非法添加罂粟壳的方法主要有气相色谱法[3]、高效液相色谱法[4]、气相色谱-质谱法[5,6]、液相色谱-质谱法等[7 - 10]，其中液相色谱-质谱法兼具灵敏度高及抗干扰性强的优势，广泛应用于火锅底料中非法添加罂粟壳的分析检测。然而火锅底料中含有大量的油脂和色素，基质效应较明显，色谱-质谱分离检测前需对样品进行一定的前处理。林黛琴等[11]用正己烷来去除火锅底料中的油脂和色素。近年来，有很多研究是用普通的固相萃取小柱来进行样品净化[12 - 15]。这两种净化方式都存在因步骤繁琐，操作不当而造成待测物一定的损失，进而影响定量的准确性。

国家食品药品监督管理局国食药监食[2012]3号文件附件3 《火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-质谱法》、上海市食品安全地方标准(DB 31/2010-2012)《火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定液相色谱-串联质谱法》，以及一些文献报道[16,17]中的前处理均采用了分散固相萃取技术。虽然该净化方法简便、快速、廉价，但一些油脂和色素含量高的样品，特别是对火锅底料的净化效果一般，基质效应较为明显。本研究在以分散固相萃取技术对火锅底料进行初步净化的基础上，再结合通过式固相萃取技术进行深度净化。本文建立的分散固相萃取，结合固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法检测火锅底料中的5种罂粟壳生物碱，方法灵敏、简便、高效，且操作简单、迅速、准确，能有效降低基质干扰，可满足火锅底料的质量监测需求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent-1290高效液相色谱仪-Agilent 6425串联四极杆质谱仪(美国，Agilent公司)；Mili-Q纯水仪(美国，Millipore公司)；MS3旋涡混合器(德国，IKA公司)。

标准品：盐酸罂粟碱(批号：171214-201205，质量分数99.9%)、蒂巴因(批号：171216-200403，质量分数100%)，中国食品药品检定研究院；吗啡(批号FE031914-02，质量浓度1.0 mg/mL)、可待因(批号：FE013113-03，质量浓度1.0 mg/mL)，美国Cerilliant公司；那可丁(批号：N1300000，质量分数97.1%)，European Phamacopoeia Reference Standard公司。甲酸铵、NaCl、无水Na2SO4均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，购自德国Merck公司；十八烷基键合硅胶吸附剂(C18-N)和氨丙基乙二胺吸附剂(NH2-PSA)购自上海岛津技迩公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(6 mL，200 mg)购自美国Waters公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取盐酸罂粟碱、蒂巴因和那可丁标准品各10 mg，分别用含0.5%甲酸的乙腈溶解后，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL作为标准品储备溶液(浓度为1 000 mg/L)。分别精密吸取上述标准品储备溶液，以及吗啡、可待因标准品适当体积于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，配制成10 mg/L的混合标准溶液。精密吸取上述混合标准溶液适当体积，用乙腈稀释成0.1、0.5、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L系列浓度的混合标准溶液。

1.3 样品前处理

取2 g样品，置于50 mL聚氟乙烯离心管中，加入2 mL水，精密加入8 mL乙腈，涡旋混合1 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液直接加载到PRiME HLB固相萃取柱上，流速为1滴/秒，收集全部流出液于25 mL聚氟乙烯离心管中，加入2 g NaCl和5 g无水Na2SO4，涡旋混合5 min，5 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液转移至25 mL聚丙烯离心管中，待进一步净化。在待净化样液中加入净化剂(内含1 000 mg无水Na2SO4、300 mg C18-N及300 mg NH2-PSA)，旋涡混匀1 min，以5 000 r/min的速度离心5 min。准确移取4.00 mL上清液于40 ℃下氮吹至干，0.5 mL流动相复溶，用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.4 色谱和质谱条件

Waters CORTECS UPLC HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流动相：A相为含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液，B相为乙腈。梯度洗脱程序：0～0.5 min，5%～12%A；0.5～4.0 min，12%A；4.0～5.0 min，12%～5%A；5.0～6.0 min，5%A。柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min，进样量：1 μL。

离子源：电喷雾电离，正离子模式(ESI+)扫描；多反应监测模式(MRM)检测；干燥气温度：200 ℃；干燥气流速：14 L/min；毛细管电压：3.5 kV；毛细管出口电压(Fragmentor)：380 V；校准方法：质量轴自动调谐校正；MRM进行分段扫描：0～2.0 min，那可丁；2.0～2.8 min，盐酸罂粟碱；2.8～3.9 min，蒂巴因；3.9～4.25 min，吗啡；4.25～6.0 min，可待因。其他质谱分析参数详见表1。

表1 5种罂粟壳生物碱的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

精密取浓度为0.5 mg/L的5种生物碱标准溶液分别注入进样器，随流动相直接进入质谱仪进行MRM分析。发现5种罂粟壳生物碱在正离子模式下的稳定性和重复性较负离子模式好，故本方法采用正离子模式进行检测。在正离子模式下对5种罂粟壳生物碱在m/z250～450范围内进行全扫描，得到[M+H]+峰。确定母离子之后，调节离子源电压，最终当离子源电压为3.5 kV时一级扫描响应最高。确定母离子及其条件后，继续进行子离子扫描，确定母离子相应的子离子，得到最佳的二级质谱条件，经仪器自带的二级质谱参数自动优化程序，得到5种目标化合物的二级质谱优化参数(表1)。最终将优化后得到的定量定性离子对和碰撞能量作为5种罂粟壳生物碱的扫描参数。

2.2 色谱条件的优化

图1 5种罂粟壳生物碱(10 μg/L)MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 5 alkaloids from pericarpium papaveris(10 μg/L)Peak identifications:1.morphine；2.codeine；3.thebaine；4.papaverine；5.noscapine.

本文比较了Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(100 mm×2.1mm，1.7 μm)、Waters CORTECS UPLC HILIC柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) 4种色谱柱对5种罂粟壳生物碱的色谱行为。由于吗啡和可待因两种生物碱为强极性化合物，其在酸性条件下无色谱保留。简龙海等[18]采用亲水作用色谱柱来对罂粟壳生物碱进行分析，国家食品药品监督管局国食药监食[2012]3号文件附件3《火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-质谱法》和上海市食品安全地方标准DB 31/2010-2012《火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法》也采用该类型色谱柱。但本文在实际分析中发现使用该色谱柱分析时，吗啡和可待因，罂粟碱、那可丁和蒂巴因分离度均比较差，质谱分析过程中会产生竞争性离子抑制，降低各目标物的灵敏度，所以我们选用Waters CORTECS UPLC HILIC柱作为罂粟壳生物碱的分析色谱柱。该分析柱采用实心核颗粒技术，5种生物碱能达到较好的分离效果，降低目标物的竞争性离子抑制效果。5种罂粟壳生物碱的MRM色谱谱图见图1。

2.3 提取和净化方式的优化

分散固相萃取技术提取溶剂一般采用乙腈，而通过式固相萃取技术上柱溶液一般采用含一定比例水的乙腈溶液，罂粟壳生物碱的提取溶剂一般采用甲醇、乙腈等溶剂，所以本文采用80%乙腈溶液作为火锅底料中罂粟壳生物碱的提取溶剂。样品经80%乙腈溶液提取后，提取液先经过PRiME HLB固相萃取柱进行初步净化，然后再用含一定比例的无水Na2SO4、C18-N及NH2-PSA组成的净化剂进行进一步净化处理。本文通过正交试验对三种成分的配比进行优化，无水Na2SO4(一般为500～1 500 mg)、C18-N(一般为100～300 mg)及NH2-PSA(一般为100～300 mg)用量，分别作为因素A、B、C，每个因素取三个水平，按照L9(33)正交表试验，比较20 μg/kg加标浓度水平下各因素组合的回收率和净化效果，选择最佳配比组合。正交试验因素见表2。正交试验结果表明，使用1 000 mg无水Na2SO4、200 mg C18-N以及300 mg NH2-PSA组成的净化剂可以获得最佳的净化效果。

油脂和色素是火锅底料主要的基质干扰物质，本文首先使用通过式固相萃取技术，对提取液进行初步净化，除去部分油脂和色素，再利用分散固相萃取技术，将初步净化液用含一定比例的无水Na2SO4、C18-N及NH2-PSA组成的净化剂进行进一步净化处理，以吸附剩余的油脂和色素。通过将分散固相萃取技术与通过式固相萃取技术相结合的方式对油脂和色素含量高的火锅底料进行复合式净化。此方式不仅有效净化样品溶液，而且显著提高了样品分析的通量。此外，本文对通过Oasis PRiME HLB固相萃取柱的最佳的乙腈比例进行研究，分别考察75%、80%、85%三种乙腈比例对20 μg/kg加标浓度水平下的基质效应的影响(回收率)，发现当乙腈的比例为80%时，5种目标化合物提取效率最高，基质效应最低(图2)。

表2 无水Na2SO4、C18-N及NH2-PSA用量配比的正交试验因素水平

图2 不同乙腈浓度时5种罂粟壳生物碱(加标浓度为20 μg/kg)的回收率Fig.2 Recoveries of 5 alkaloids from pericarpium papaveris(spiked with 20 μg/kg)with different acetonitrile concentrations

本文通过基质效应来评价采用的分散固相萃取技术结合通过式固相萃取技术的复合式净化效率。基质效应用基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线的斜率之比进行评估，基质标准曲线配置如下：分别取6份空白样品2.0 g(检测结果为阴性的火锅底料)于50 mL聚丙烯离心管中，分别精密加入混合对照品储备溶液(浓度为1.00 mg/L)适当体积，按“1.3”制备基质标准曲线，配制成最终浓度为0.1、0.5、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L的基质标准品系列溶液，按“1.4”条件进行分析，得到以火锅底料为基质的基质标准曲线，所得的基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线的斜率的百分比进行评估。一般情况下，基质效应在85%～115%之间不存在明显的基质效应，本文结果基质效应范围在91.5%～98.3%之间。所以本方法较好的消除了基质效应，有效的保证了定性、定量结果的准备、可靠。

2.4 线性关系、定量限以及重复性

取“1.3”中已配制的标准品系列溶液，分别进样1 μL，以定量监测离子对的离子流中色谱峰峰面积(Y)为纵坐标，标准品浓度(X，μg/L)为横坐标进行线性关系考察，结果见表3。5种罂粟壳生物碱在各自线性范围内线性关系良好(r2均大于0.9954)。取空白样品2.0 g(检测结果为阴性的火锅底料)，加入适当稀释的混合标准品溶液，按“1.4”制备供试品溶液，得信噪比为3和10时分别为5种罂粟壳生物碱的检测限(LOD)与定量限(LOQ)，结果见表3。

表3 5种罂粟壳生物碱的线性范围、回归方程、检测限和定量限

2.5 方法回收率与精密度

取空白样品(检测结果为阴性的火锅底料)，每份称取样品2.0 g，分别加入适量的标准品溶液，使供试品溶液最终加样浓度分别为低、中、高3个水平(其中那可丁、罂粟碱和蒂巴因加标浓度分别约为1、20、100 μg/kg，吗啡和可待因的加标浓度分别约为20、100、200 μg/kg)，平行6份，按样品制备方法制备供试品溶液，检测含量，计算回收率，结果见表4。5种罂粟壳生物碱的三个浓度水平的平均回收率为82.5%～95.9%，相对标准偏差为(RSD)为3.4%～8.6%。

表4 火锅底料中5种罂粟壳生物碱的回收率与精密度试验(n=6)

2.6 实际样品检测

利用本文建立的优化后的前处理和色谱-质谱条件，完成了2017年度国家食品药品监督抽验计划(火锅底料专项)。结果显示，40批次的火锅底料均未检出5种罂粟壳生物碱成分。

3 结语

本研究建立了分散固相萃取，结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定火锅底料中5种罂粟壳生物碱的分析方法，优化了色谱质谱条件以及提取和净化条件。该方法无需太复杂的样品前处理条件，经80%乙腈溶液提取，先用Oasis PRiME HLB固相萃取柱进行初步净化，再使用1 000 mg无水Na2SO4、300 mg C18-N以及300 mg NH2-PSA组成的净化剂进一步净化处理，样品提取液经复合式净化后，有效地降低了基质效应，提高了分析方法的选择性和灵敏度。