气相色谱-质谱法测定药品中克霉唑的含量

韩 超，胡贝贞，胡 侠，王石磊，沈 燕，雷美康

(1.浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015；2.绍兴海关综合技术服务中心，浙江绍兴 312000；3.联勤保障906医院，浙江温州 325000；4.杭州海关技术中心，浙江杭州 310016)

克霉唑为咪唑类广谱抗真菌药，是治疗真菌感染疾病的合成抗菌药，对多种真菌尤其是白色念珠菌具有较好的抗菌作用[1,2]。以往药品中克霉唑的测定主要采用的是高效液相色谱法[3 - 6]，但由于药品基体复杂，采用液相色谱法测定缺乏克霉唑分子量信息，在定性方面存在不足，影响含克霉唑药物的质量控制。色谱与质谱联用技术测定克霉唑报道较少，且主要集中在环境和食品中的克霉唑残留检测[7,8]。气相色谱-质谱法具有分析时间短、分离效果好、定性准确等优势，已经在相关药品质量控制中得到了广泛应用[9 - 12]。

本文建立气相色谱-质谱法测定药品中克霉唑的含量，同位素内标法定量，方法快速、简便、准确，可用于含克霉唑药品的质量控制。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国，安捷伦公司)；Elma P 300 H超声波清洗器(德国，Elma公司)；MS3 basic涡旋振荡器(IKA公司)；分析天平(梅特勒-托利多公司)。

克霉唑标准品(纯度99.9%，CAS23593-75-1)由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH提供，克霉唑-d5(纯度99.0%)由加拿大CDN公司提供。丙酮、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、环己烷均为色谱纯(美国Fisher Scientific)。

1.2 标准溶液配制

取克霉唑标准品10 mg，用乙腈溶解并转移至100 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100 μg/mL克霉唑标准储备溶液。取克霉唑-d5标准品1 mg，用乙腈溶解并转移至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制100 μg/mL克霉唑-d5标准储备溶液。用乙腈逐级稀释，配成0.05、0.1、0.2、1.0、5.0 μg/mL的系列浓度标准曲线溶液，其中克霉唑-d5同位素内标溶液浓度均为0.2 μg/mL。

1.3 样品制备

1.3.1 含有克霉唑的片剂、乳膏和凝胶样品制备和提取取一片含有克霉唑的片剂用水溶解并定容至500 mL；称取1.0 g含有克霉唑的乳膏，含有克霉唑的凝胶取一支，分别用水溶解并定容至30 mL。各取1 mL上述液体，加入5 mL乙腈提取，再加入1 g NaCl盐析，静置分层，移取乙腈层至10 mL刻度离心管中，下层再加入5 mL乙腈进行提取，合并提取层于10 mL刻度离心管中并用乙腈定容至10 mL。取上述定容液10 μL于10 mL容量瓶中，加入100 μg/mL克霉唑-d5标准储备溶液20 μL，用乙腈定容至10 mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱测定。

1.3.2 含有克霉唑的栓剂样品制备和提取取含有克霉唑的栓剂一枚，用乙酸乙酯∶环己烷(1∶1,V/V)溶解并定容至100 mL。取10 μL上述液体，置于10 mL容量瓶中，加入100 μg/mL克霉唑-d5标准储备溶液20 μL，用乙腈定容至10 mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱测定。

1.3.3 含有克霉唑的溶液样品的制备和提取取1 mL含有克霉唑的溶液，加甲醇稀释并定容至10 mL。取10 μL上述液体，于10 mL容量瓶中，加入100 μg/mL克霉唑-d5标准储备溶液20 μL，用乙腈定容至10 mL，制得待测样品溶液，供气相色谱-质谱测定。

1.4 气相色谱-质谱条件

1.4.1 气相色谱条件DB-35 MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升温：初温60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至200 ℃，再以15 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。载气为氦气(纯度≥99.999%)，流速1.0 mL/min，进样口温度260 ℃，不分流进样，进样量1 μL。

1.4.2 质谱条件离子源温度300 ℃，传输线温度310 ℃，四极杆温度180 ℃，溶剂延迟5 min。EI电离模式，电离能70 eV。监测模式：全扫描(SCAN)和选择离子监测(SIM)模式同时进行，SCAN扫描范围m/z50～400，SIM监测离子m/z165、243、278，其中定量离子为m/z165，克霉唑-d5监测离子m/z170、248、283，其中定量离子为m/z283。

2 结果与讨论

2.1 质谱参数的优化

图1 克霉唑(A)及克霉唑-d5(B)的全扫描质谱图Fig.1 Full scan mass spectrograms of clotrimazole(A) and clotrimazole-d5(B)

在EI电离源下，对10 mg/L的克霉唑及克霉唑-d5标准溶液分别进行一级质谱全扫描，得到每个目标物的全扫描谱图，见图1。选择丰度最强的三个离子作为定性离子，选择丰度最强的离子作为定量离子，克霉唑定性离子为m/z165.1、243.2、278.1，定量离子为m/z165.1；克霉唑-d5定性离子为m/z170.1、248.2、283.1，定量离子为m/z283.1。选择离子监测谱图见图2。

图2 0.2 μg/mL的克霉唑(A)及克霉唑-d5(B)标准溶液的选择离子色谱图Fig.2 Selective ion mode chromatograms of clotrimazole(A) and clotrimazole-d5(B) standard solution(0.2 μg/mL)

2.2 提取条件的优化

根据不同药品类型，分别采用不同溶剂进行快速有效提取。不同类型的药剂(片剂、溶液、乳膏、栓剂、凝胶)含有不同的辅料，需要用不同的溶剂先溶解样品以获得澄清的液体，使所含的克霉唑均匀分布在溶剂中，才能进行下一步的提取。本实验根据不同类型的药剂，选取了含克霉唑的片剂、溶液、乳膏、栓剂、凝胶5种常见的药品，根据其所含的辅料不同，选取水、甲醇或乙酸乙酯∶环己烷(1∶1,V/V)预溶解样品。采用有机溶剂溶解的样品经乙腈稀释一定倍数后直接供气相色谱-质谱测定，采用水溶解的样品用乙腈反萃取其中的克霉唑，然后稀释一定倍数后供气相色谱-质谱测定。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系取“1.2”方法制备的0.05、0.1、0.2、1.0、5.0 μg/mL系列标准工作溶液进行上机测定，以克霉唑与克霉唑-d5的峰面积比值为纵坐标(Y)，克霉唑与克霉唑-d5的质量浓度之比为横坐标(X)绘制标准曲线，同位素内标法定量。结果表明，在0.05～5.0 μg/mL浓度范围内，克霉唑线性关系良好，回归方程为:Y=0.285+2.364X，相关系数(r2)为0.9997。

2.3.2 稳定性考察取同一份样品溶液，在室温下放置0、4、8、16、24 h后进气相色谱-质谱分析，测定峰面积，克霉唑峰面积的相对标准偏差(RSD)为4.3%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 精密度试验取按照“1.2”方法制备克霉唑标准品溶液，分别配制成高、中、低3种不同浓度(5、0.2、0.05 μg/mL)的溶液，按照“1.4”气相色谱-质谱条件连续进样6次，测定峰面积，克霉唑峰面积的RSD为4.6%。

2.3.4 重复性试验精密称取同一批片剂药品6份，按照“1.3”方法制备供试品溶液，分别进行气相色谱-质谱测定，RSD为4.2%，表明重复性良好。

2.3.5 回收率与精密度对各个类型样品进行加标回收率实验，结果见表1。测得克霉唑的回收率在91.1%～97.2%之间，RSD为3.8%～6.5%。

表1 加标回收率和RSD结果

2.4 样品测定

应用本方法对市面药店里随机购买的含有克霉唑的药品进行分析，所得结果列于表2。检测结果和各种剂型的标示量相比相差不大，代表性样品里克霉唑的全扫描总离子图和定性全扫描质谱图见图3。

表2 药品中克霉唑含量

图3 含克霉唑的代表性样品全扫描色谱图(A)和定性全扫描质谱图(B)Fig.3 Full SCAN chromatogram(A) and SCAN mass spectrogram(B) of representative samples containing clotrimazole

3 结论

本文建立了同位素稀释，气相色谱-质谱法测定药品中克霉唑含量的方法。本方法针对不同药品的剂型和所含辅料不同，优化了前处理条件，方法前处理简单、精密度及准确性好和灵敏度高，可为含克霉唑药品的安全监测提供技术支持。