山羊鼻内肿瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

肖霜艳，翟少伦，陈小文，谢逸伦，周秀蓉，吕殿红，温肖会，翟 颀，贾春玲，魏文康，刘正飞

（1.华中农业大学动物医学院，武汉430000；2.广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州 510640；3.四会市畜牧兽医局，四会526200）

羊鼻内肿瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus，ENTV）属于反转录病毒科β反转录病毒属，主要有山羊鼻内肿瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus-2，ENTV-2）和绵羊鼻内肿瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus-1，ENTV-1）两种类型，分别以山羊和绵羊为易感宿主[1]。1995年，在内蒙古首次发现我国的羊鼻内肿瘤（enzootic nasal tumor，ENT）病例[2]。

随着对ENT的调查研究发现，该病四季可发，存在地域性差异，可水平传播[3]。传染源主要是患病羊、带毒羊以及被污染的牧草等，可通过直接接触感染其他羊群。ENTV-2的检出率在0.5%～15%[4]，致死率高达100%。目前，ENTV-2在我国内蒙古、湖南、四川、陕西、广东和重庆等地相继被检测出来，流行范围呈现扩大的趋势[2-3,5-7]。ENTV-2与ENTV-1、绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）以及内源性反转录病毒（Endogenous retrovirus，ERVs）在基因序列上有较高的同源性，可高达88%以上[8]。ENTV-2多分布在血液、拭子、组织等样品中，在血清中的拷贝数较低，这给ENTV-2的检测和鉴别带来了极大的挑战。实时荧光定量RT-PCR法特异性高、检测限低，适合应用于ENTV-2在血清中的检测[9-10]。本研究针对env基因设计特异性引物和探针，建立了检测ENTV-2的荧光RT-qPCR方法。

1 材料和方法

1.1 质粒、对照品及试剂 山羊鼻内肿瘤病毒阳性重组质粒由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存；病毒基因组提取试剂盒购自AXYGEN公司；一步法RT-PCR扩增试剂、胶回收试剂盒、E.coli DH5α感受态细胞、DL600 DNA marker购自TaKaRa公司；……