大鼠自身免疫性听神经病模型的建立*

周媛 王斌 罗军

听神经病缺乏有效的治疗，其发病机制及病理仍需进一步研究。有研究表明，内耳自身免疫可能是引起听神经病的重要原因[1～3]。P0蛋白是周围神经髓鞘细胞膜上的一种结构蛋白，其含量约占细胞膜蛋白含量的50%以上；该蛋白在内耳中分布于耳蜗螺旋神经节、听神经的有髓神经纤维髓鞘中[4]。Cao等[5]发现P0蛋白为自身免疫性内耳病的相关抗原，并且具有内耳组织特异性；林熹等[6]用纯化的P0蛋白成功诱发了豚鼠内耳自身免疫反应。本研究拟用P0蛋白免疫大鼠，增加P0蛋白免疫量，并延长免疫周期，旨在建立免疫成功率更高的自身免疫性听神经病动物模型，为听神经病的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1P0蛋白的提取和纯化 健康SD大鼠20只，雌雄不限，体重250～300克，由郑州大学实验动物中心提供。用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔内注射麻醉，动物麻醉后断头，迅速取出听泡，在无菌及4 ℃条件下取出全膜迷路组织，参照林熹[6]的方法，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)提取和纯化P0蛋白：将全膜迷路组织置于含1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、10 mmol/L二巯基乙醇(β-ME)和40 mg/ml苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(均购于sigma，美国)的PBS中，反复冻融4次，4 ℃下以12 000转离心30分钟，取上清蛋白液，即为粗提膜迷路蛋白液；采用BCA(bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)法测定蛋白浓度，BCA试剂盒购自赛默飞公司。分别灌制浓度为5%的浓缩胶和浓度为12.5%的分离胶，将粗提膜迷路蛋白液与等体积的样品缓冲液(4%SDS、2%二巯基乙醇和l%溴酚蓝)沸水浴3分钟，加样4 ℃下恒温电泳，当溴酚蓝泳至胶的底部时结束电泳。……