吴茱萸碱联合自噬抑制剂氯喹抗肝癌作用的研究

沈星星,时乐，姚亮宇，牛玉珍,梁涛

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023；2.南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029)

吴茱萸碱(EVO)是从中药吴茱萸中提取的天然生物碱，除具有较强的抗炎、镇痛作用外，还有抗肿瘤的作用[1]。有研究发现EVO在人结肠癌[2]和人胃癌细胞[3]中能诱导自噬并抑制肿瘤，而在小细胞肺癌中能诱导自噬并对肿瘤有保护作用[4]，推测EVO对不同的肿瘤自噬效果不同。氯喹(CQ)是预防和治疗疟疾的常用药，最近研究表明，CQ能通过抑制自噬和增强人体免疫力，发挥抗肿瘤作用。越来越多证据表明，抗肿瘤药物与CQ联合使用能起到协同作用，增强抑制肿瘤的能力。肝细胞癌是世界范围内最常见的血管实体瘤之一,具有血管浸润的特性，而自噬对肿瘤的发展和血管的生成作用之间的相关性是近年来研究的热点[5-7]。目前,已有研究证明EVO在人肝细胞癌HCC中可以降低VEGFA的转录活性,抑制血管生成,发挥抗肝癌的作用[8]。但EVO对肝癌细胞的自噬作用还未见报道，EVO联合CQ对肝癌细胞的活性和血管生成能力的作用也有待探讨。

1 材料

1.1 细胞与试剂

人肝癌细胞HepG2购自上海酶联生物科技有限公司。人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)来自南京中医药大学袁东平课题组。EVO标准品(HPLC≥98%)，货号:B21315,上海源叶生物科技有限公司，用DMSO溶解并稀释至1.25、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L作为母液；CQ，美国SIGAM公司，货号：c6628-25G，用纯水溶解并稀释至25 mmol/L作为母液；VEGFA ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司;DMEM培养液和胎牛血清,美国Gibco公司；青链霉素混合液，货号：P1400，索莱宝科技有限公司；细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)，货号：G0170,索莱宝科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒，货号：P0012,碧云天生物科技研究所；CCK8,货号:C0038,碧云天生物科技研究所；Matrigel，货号：356234，美国BD公司；抗荧光淬灭封片，货号：P0126-25 mL，碧云天生物科技研究所；LC3抗体，货号：14600-1-AF，美国Proteintech公司；VEGFA抗体，货号：66828-1-Ig，美国Proteintech公司；P62抗体，货号：18420-1-AP，美国Proteintech公司；二抗经辣根过氧化物酶HRP标记过的羊抗兔或羊抗小鼠IgG(H+L)，货号：SA00001-2,美国Proteintech公司；SDS-PAGE快速凝胶速配试剂盒，货号：P0012AC,碧云天生物科技研究所；磷酸酶抑制剂混合液，货号：KGP602，凯基生物有限公司。

1.2 仪器

恒温二氧化碳细胞培养箱，美国STIK公司；倒置荧光显微镜，德国Leica公司；垂直电泳槽，美国Bio-Rad公司；凝胶扫描成像系统，美国Bio-Rad公司；Infinite M200 Pro酶标仪，瑞士TECAN公司。

2 方法

2.1 细胞培养

HepG2细胞和HUVEC细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中进行常规传代培养，取对数生长期的HepG2、HUVEC细胞，调整细胞密度,根据实验要求接种于96或6孔板中，待细胞完全贴壁后加入不同药物进行处理。

2.2 CCK8法检测

2.2.1 不同浓度EVO对HepG2细胞活性的影响 取对数生长期HepG2细胞，调整细胞密度为5 000 mL-1接种于96孔板，每孔100 μL置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。加入不同浓度的EVO培养12、24、48 h，浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，每组10个复孔，分别在12、24、48 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养2 h后用酶标仪(波长450 nm)记录每孔的吸光度(A)。细胞存活率=A实验组/A空白对照组×100%。

2.2.2 EVO联合CQ对HepG2细胞活性的影响 根据前期研究及参考文献[8-9]，将细胞分为空白对照组、EVO组(10 μmol/L)、CQ组(25 μmol/L)、EVO+CQ组(10 μmol/L+25 μmol/L)，每组10个复孔，作用24 h后检测细胞活性。

2.3 Western blot检测

取对数生长期细胞，接种于6孔板，每孔2×105个细胞，加入不同浓度(0、5、10 μmol/L)的EVO，每组3个复孔，培养24 h后提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，参考文献电泳分离，转膜，封闭，用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、VEGFA抗体孵育，以GAPDH为内参，用Image J图像分析软件进行扫描分析。

2.4 MDC染色

取对数生长期HepG2细胞，接种于6孔板，每孔2×105个细胞，细胞分组及处理方法见2.2.2，24 h后参考细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)说明书染色，于倒置荧光显微镜(激发滤光片波长355 nm，阻断滤光片波长512 nm)下观察各组细胞染色情况。

2.5 ELISA检测

取对数生长期HepG2细胞调整至合适细胞密度接种于48孔板中，分组和处理同2.2.2,每组10个复孔，培养24 h后，提取各孔细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测VEGFA的表达水平。

2.6 细胞侵袭实验

HepG2细胞，分组同2.2.2,无血清培养液培育24 h后取其上清液作为HUVECs的条件培养基，将HUVECs分为空白对照组、EVO组、CQ组、EVO+CQ组。取对数生长期的HUVECs调整密度为2×105mL-1，接种到Transwell小室并加入上述各组条件培养基，下室加全培养液，之后常规条件下培养48 h。用PBS洗小室1～2次，风干后，放入约200 μL免疫荧光固定液中，室温固定30 min后风干，再将小室放入预装500 μL结晶紫染色液的孔中，室温染色30 min。染色结束后用纯水冲洗浸泡数次，直到洗液颜色清澈，风干。显微镜下随机取9个视野计数并统计。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度的EVO对HepG2细胞的影响

由表1可知不同浓度的EVO处理HepG2细胞12 h后对HepG2细胞增殖无明显抑制作用。当作用24、48 h后，EVO对HepG2细胞增殖有显著的抑制作用(P<0.01)，其中处理24 h时，EVO对HepG2的抑制作用呈浓度依赖性。同时选择抑制作用适中的5、10 μmol/L，进行后续实验。

表1 EVO对HepG2细胞活性的影响

3.2 EVO对HepG2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、VEGFA蛋白表达的影响

由图1可知，HepG2细胞经5、10 μmol/L的EVO作用24 h后，自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达增加，P62蛋白的表达降低，说明EVO能增加HepG2细胞的自噬水平，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。同时与空白对照组相比,EVO(10 μmol/L)组血管生成相关蛋白VEGFA的表达显著下降(P<0.01)。

注：与空白对照组相比,*P<0.05，**P<0.01。

3.3 EVO联合CQ对HepG2细胞活性的影响

如表2所示，与空白对照组相比，EVO组和CQ组能显著抑制HepG2细胞活性(P<0.01)；与EVO相比，EVO+CQ组对HepG2细胞活性的抑制作用更为显著(P<0.01)。

表2 EVO联合自噬抑制剂CQ对HepG2细胞活性的影响

3.4 EVO联合CQ对HepG2细胞自噬的影响

MDC染色结果如图2所示，与空白对照组相比，EVO组细胞内绿色荧光信号显著增强，提示细胞内有大量自噬小体聚集，自噬被增强。与EVO组相比，EVO+CQ组细胞内绿色荧光信号大面积增强，提示LC3自噬小体聚集增多。

图2 MDC法检测EVO联合CQ对HepG2细胞自噬的影响

3.5 EVO联合CQ对HepG2细胞VEGFA表达水平的影响

由图3可知，与空白对照组相比，EVO组及EVO+CQ组的VEGFA表达水平明显下降(P<0.05,P<0.01)。与EVO组相比，EVO+CQ组VEGFA的表达水平显著下降(P<0.05)。

注：与空白对照组相比,**P<0.01，*P<0.05；与EVO组相比,图3 EVO对HepG2细胞VEGFA表达水平的影响

3.6 EVO的条件培养液对HUVEC细胞侵袭能力的影响

由图4可知，与空白对照组相比，EVO组和EVO+CQ组细胞侵袭能力显著下降(P<0.01)。与EVO组相比，EVO+CQ组抑制细胞侵袭能力的作用更为显著(P<0.01)。

注：与空白对照组相比,**P<0.01;与EVO组相比,##P<0.01。

4 讨论

肝细胞癌是一种以新血管生成为特征的恶性肿瘤，是肝癌中最常见的病理类型，其复发率高，预后多不良，目前临床上仍然没有较好的治疗方法[10]。有研究表明，肝细胞癌中VEGFA的表达水平直接影响其新血管生成能力[11]，VEGFA的高表达能促进肝癌的进展，降低患者的存活率[12]，所以抗血管生成疗法在治疗肝细胞癌中得到广泛的应用。有证据表明，靶向血管生成的药物可能会影响肿瘤的自噬途径[13]，而自噬在肿瘤微环境中的作用和对血管生成的影响是目前关注的焦点[5-6]，已有研究发现，当抗血管生成的药物与自噬抑制药物联合使用时能更有效地抑制肿瘤的进展[9,14]。目前EVO通过抑制血管生成发挥抗肝癌的作用效果已得到证明[8]，但其在肝癌细胞中的自噬作用及联合自噬抑制剂对肝癌细胞的影响还有待进一步研究，因此本文就EVO及EVO+CQ对HepG2细胞的活性、自噬水平和血管生成情况等进行初步研究，结果发现EVO能有效抑制HepG2细胞的活性，提高HepG2细胞自噬水平，降低VEGFA的表达水平。当EVO与自噬抑制剂CQ联合使用时，其抑制HepG2活性能力增强，自噬小体明显增多并能显著降低HepG2细胞VEGFA的表达水平和HUVECs细胞的侵袭能力。这表明EVO与CQ联合使用能增强其抗肝癌和抑制血管生成作用，但其中具体作用机制还有待进一步探究。