雷公藤甲素抗肿瘤作用及其配伍减毒机制的研究进展

宋祎，刘琰，方冰倩，康迪，胡立宏

(南京中医药大学药学院，江苏省中药功效物质重点实验室，江苏 南京 210023)

雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇(Triptolide，TP)，是从传统药用植物雷公藤的根部中提取的一种环氧二萜内酯类化合物，是雷公藤提取物中活性成分最具代表性的一类天然产物。自1972年首次分离以来，TP因其较强的抗炎、免疫抑制和广谱的抗肿瘤等多种药理活性引起研究人员愈来愈多的关注[1-2]。其中，TP在近60种肿瘤细胞株中均可发挥良好的抗肿瘤活性[3]。然而，TP发挥活性的起效剂量与毒性剂量相接近，导致治疗窗口较窄。高活性TP诱发多器官的不良反应制约了其在临床中的应用。本文对TP抗肿瘤的作用机制、体外与体内毒性发生、体内药代动力学特征以及可能的配伍减毒策略进行综述。

1 雷公藤甲素抗肿瘤作用的分子机制

1.1 抑制细胞活力

TP能广泛地抑制多种肿瘤细胞的活力，包括白血病、骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤，和乳腺癌、卵巢癌、肺癌等实体瘤。对多种白血病细胞株，TP均具有较强的抑制活力。其中TP作用72 h在急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)细胞株MV4-11中的半数抑制浓度(The half maximal inhibitory concentration,IC50)达到5.6 nmol/L[4]，对其他AML细胞的IC50值在4～17 nmol/L之间[5]。除AML外，其他类型白血病和骨髓瘤细胞株对TP的敏感性略弱于AML细胞系，其IC50在30～50 nmol/L范围内[6-8]。而TP对不同实体瘤细胞的抑制活性有所区别。在乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7中作用24 h，TP的IC50值分别为209、171 nmol/L[9]。肺癌细胞PC9及A549中作用48 h，TP的IC50值分别为29、136 nmol/L[10]。TP对于胰腺癌细胞Capan-1(10 nmol/L)、Capan-2(20 nmol/L)及SNU-213(9.6 nmol/L)细胞毒作用较强，而对于HS766T,SNU-410和HPAF-Ⅱ细胞则没有明显抑制活性[11]。据报道，TP诱导细胞毒作用发生的机制与许多基因和所在信号通路有关，主要包含以下几个方面。见表1。

表1 TP对不同肿瘤细胞的抑制活性

1.1.1 阻断细胞周期 TP属于细胞周期非特异性抗肿瘤药物，使细胞周期阻滞在不同阶段，有效抑制肿瘤细胞的增殖并阻止其继续生长。肖婧薇等[16]发现TP作用于胃癌细胞SGC-7901 24 h，结果显示SGC-7901细胞周期被阻滞在S期，并呈现剂量依赖性。在胰腺癌细胞中，TP通过抑制细胞周期检查点激酶来增强吉西他滨诱导的S期停滞[17]。Oliveira等[18]发现TP通过抑制E2F1的转录激活使结肠癌细胞的细胞周期阻滞于G1期。郑群芳等[19]报道，TP可显著抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，其作用机制为影响细胞周期因子Cyclin B1的表达从而阻滞Hela细胞于S期和G2/M期。不同研究均表明TP可以调控细胞周期相关蛋白的表达抑制增殖，发挥肿瘤抑制活性。

1.1.2 促进细胞凋亡 调控肿瘤细胞凋亡是TP抑制肿瘤细胞活力的有效手段之一。细胞凋亡是细胞程序性死亡的主动过程，可分为细胞膜上死亡受体(Fas)介导的外源性凋亡和细胞内部发生应激或者损伤导致线粒体膜通透性改变引起的内源性凋亡。Hung等[20]研究发现TP能促进死亡受体与配体的表达诱导人黑色素瘤细胞A375.S2的凋亡。Wang等[21]也发现，TP可诱导人胰腺癌细胞PANC-1、宫颈癌细胞Hela、骨肉瘤细胞U2OS凋亡，且依赖于死亡受体途径。定位于线粒体的Bcl-2家族蛋白控制线粒体的通透性以及细胞色素C的释放，通过Caspase家族成员发生级联反应调控内源性凋亡，也是TP调控肿瘤细胞凋亡的主要途径之一[22]。Ma等[23]研究发现，TP使胰腺癌细胞上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2，诱导其凋亡。蔡风景等[24]将TP作用于C6胶质瘤细胞，发现TP可以抑制C6胶质瘤细胞NF-κB表达激活Caspase级联反应。娄引军等[25]发现TP对多发性骨髓瘤的抑制作用可能是通过抑制NF-κB，激活Caspase-3促进多发性骨髓瘤的细胞凋亡。此外，热休克蛋白(HSP)是一类被应激因素激活，调节细胞凋亡的关键蛋白，其在许多实体瘤中高表达。TP通过抑制HSP70基因的启动子下调其表达，促进细胞色素C的释放，进而激活肿瘤细胞线粒体凋亡途径，并且不阻碍正常肿瘤细胞的生长[26-28]。

1.1.3 诱导细胞自噬 除细胞凋亡外，TP也可诱导肿瘤细胞自噬。自噬是真核细胞为实现内环境稳态而产生的溶酶体依赖的一种自我消化过程，可以诱导细胞发生不依赖于Caspase级联反应介导的程序性死亡——自噬性死亡。LC3是自噬相关标志蛋白，有两种存在形式LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ。其中，LC3-Ⅱ的表达水平与自噬体的数量呈正相关，常作为判断细胞自噬活性的指标[29]。此外，上调潜在的肿瘤抑制基因Beclin-1的表达也可启动癌细胞发生自噬[30]。赵林等[31]将TP作用于结肠癌HCT116细胞发现，实验组LC3-Ⅱ及Beclin-1蛋白表达量比对照组高，并呈时间依赖性，表明TP可通过上调结肠癌HCT116细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白水平促进结肠癌细胞自噬。高欢等探讨TP通过ERK信号传导通路对人乳腺癌细胞MCF-7的影响，发现其能增加LC3B-Ⅱ和Beclin-1的表达，诱导MCF-7细胞自噬，并证明可能与ERK1/2的激活有关[32]。

细胞凋亡与细胞自噬是细胞程序性死亡的两种形式，有证据表明两者既相互独立，又互相影响。不同研究人员通过建立不同实验模型，证明TP可以诱导凋亡或自噬引起细胞死亡，提示TP具有广泛作用，而TP对于细胞自噬和凋亡调控之间存在着怎样的联系还需要进一步探究。

1.1.4 抑制细胞转录 转录是所有细胞生存所必需的生物学过程，肿瘤细胞中常高表达RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNAPⅡ)提高转录水平维持其快速增殖和存活的需要。其中，人着色性干皮病B(Xeroderma pigmentosum group B，XPB)——转录因子TFⅡH复合物的一个重要亚基，与RPB1结合保证高效转录。TP可以与XPB共价结合并抑制其ATP酶活性，引起RPB1降解从而抑制RNAPⅡ驱动的转录过程[33-34]。此外，TP还可以通过调控表观遗传的方式调控转录。据报道TP可以抑制多发性骨髓瘤细胞中H3K9和H3K27占位基因启动子的甲基化，导致细胞周期阻滞影响转录，表明TP还可以通过表观遗传发挥抗肿瘤作用[35]。

1.2 抑制肿瘤细胞迁移、侵袭与转移

上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是极性上皮细胞转化为具有运动特性的间充质细胞的生物学过程，是恶性上皮肿瘤发生侵袭和转移的基础。TP可以通过多靶点和多机制有效抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭与转移。NF-κB活化缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)进而激活转录因子TWIST，促进多种肿瘤细胞发生转移。Liu等[36]在胰腺癌细胞中发现TP下调NF-κB信号通路和相关转录因子SNAI1、SNAI2、ZEB1，以及间叶细胞标志物CDH2和Vimentin。基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9具有降解基底膜和细胞外基质的功能，能有效介导肿瘤细胞的侵袭与转移。黄骁昊等[37]初步探究了TP对子宫内膜癌HEC-1B细胞的影响，结果显示TP可通过降低MMP-2和MMP-9的活性，减弱HEC-1B细胞的侵袭性，且与作用时间呈正相关，表明TP对子宫内膜肿瘤的浸润转移具有显著的抑制作用。此外，黏着斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)是一类属于蛋白酪氨酸激酶超家族的非受体蛋白酪氨酸激酶，与肿瘤的发生和迁移密切相关。Reno等[38]发现TP可通过下调FAK的表达，在体外和体内抑制肺癌细胞的迁移与侵袭能力。

1.3 影响肿瘤微环境

肿瘤微环境是由不同类型细胞(肿瘤细胞、肿瘤干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞和免疫细胞)组成的复杂体系。细胞及细胞分泌的多种因子相互作用对肿瘤的发生发展、转移以及耐药性的产生有着重要意义。TP可以通过影响肿瘤微环境中的以下几个方面抑制肿瘤的发生和发展。

1.3.1 肿瘤干细胞 肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)目前被认为在肿瘤耐药性发生过程中发挥着重要作用。Liu等[39]发现TP可以降低胰腺癌细胞中Jagged1、Notch1、Nanog和SOX2等干细胞基因的蛋白水平。Li等[40]发现TP在体内外均可诱导乳腺癌相关CSCs凋亡。Eda等[41]发现，TP能抑制CD133+/CD44+的结肠CSCs。GD3S是参与乳腺癌CSCs标志物GD2合成的合成酶，Sarker等发现TP可以抑制GD3S的功能[42]。

1.3.2 肿瘤相关成纤维细胞及肿瘤间质 肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)分泌生长因子、趋化因子、细胞因子和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)蛋白，促进肿瘤细胞增殖，调节肿瘤代谢和免疫细胞运输。Modi等发现在胰腺癌中，致密的间质使肿瘤阻滞缺氧、血管压缩，从而导致化疗药物耐受及预后不良，而TP可以降低ECM蛋白、胶原和透明质酸的表达，减少肿瘤基质，从而抑制胰腺癌[17,43]。

1.3.3 调节炎症及免疫细胞 TP的抗炎及免疫抑制作用一直以来都被广泛认知，如治疗类风湿性关节炎等炎性疾病。TP能影响T细胞和树突状细胞(DC)集落，抑制T淋巴细胞激活，其中包括白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)受体的表达、IL-2和干扰素-γ(IFN-γ)的产生以及诱导T细胞凋亡[2]。刘彪等[44]发现TP可通过降低脾脏淋巴细胞调节性T细胞的比例，以及抑制包括IL-10和转化生长因子-β(TGF-β)在内的免疫负调控细胞因子的分泌，实现其免疫调节作用，进而抑制荷瘤鼠肿瘤的生长与增殖，且随着TP浓度的增加以及用药时间的延长，其免疫调节作用也在不断地增强。Chan等[45]研究发现TP能促进WEHI-3白血病小鼠免疫反应的发生，可通过增加T细胞(CD3+)、B细胞(CD19+)、单核细胞(CD11b+)和巨噬细胞(MAC-3+)数量，从而发挥免疫调节功能，阻碍白血病继续增殖。Hu等[46]也发现TP可抑制大鼠卵巢癌NuTu-19细胞的增殖，其机制为降低炎性因子IL-2和TNF-α的表达水平，发挥抗炎作用，从而改善NuTu-19细胞的免疫功能，抑制卵巢癌的生长。TP几乎对肿瘤微环境中所有主要的细胞类型都有作用，揭示其在肿瘤免疫治疗过程中具有广阔的前景，TP与免疫检查点抑制剂的组合方案能否进一步改善患者的临床反应值得研究者进一步的探讨。见图1。

图1 雷公藤甲素的抗肿瘤分子作用机制

2 雷公藤甲素的毒性

TP因其广泛的药理活性和出色的临床前表现逐渐被中外科学家认可，成为治疗癌症的临床候选药物。然而，发挥生物活性的TP同时亦是毒性成分，治疗窗口较窄。高活性TP诱发的多器官毒性严重制约了TP作为候选药物在临床中的应用与相关制剂的研发。其中，TP诱发的肝毒性、肾毒性以及生殖系统毒性研究较多，如肝肾功能损伤、生育能力下降等。

2.1 肝毒性

TP对人正常肝脏细胞系(L-02)有细胞毒作用，180 nmol/L的TP处理24 h抑制了52.3%的L-02细胞活力，并诱导L-02细胞发生凋亡，呈剂量和时间依赖性[47]。同样，TP抑制另外一株人正常肝脏细胞(HL-7702)的细胞活力，并引起线粒体膜的去极化和氧化应激[48]。Mei等[49]发现TP对肝脏的毒性作用与活性氧(ROS)诱导脂质过氧化及DNA损伤有关，TP通过诱导氧化应激反应造成肝损伤。组织学实验表明1 mg/kg TP腹腔注射24 h后，BALB/C小鼠肝脏细胞变性、空泡化以及坏死，同时引起血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)上升9倍[50]。

2.2 肾毒性

在人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2中，TP在80 nmol/L浓度下作用24 h对细胞增殖的抑制率大约为40%[51]。暴露24 h后，TP诱导大鼠肾小管导管上皮细胞产生细胞毒作用，IC50值为185.34 nmol/L，并下调谷胱甘肽水平，诱导ROS产生[52]。Li等[52]研究发现，TP可诱导正常鼠肾细胞系NRK-52E发生氧化应激反应，使ROS增加，GSH耗竭，最终导致肾细胞的损伤。

2.3 生殖毒性

20 nmol/L的TP作用24 h可引起大鼠卵巢颗粒细胞分泌雌二醇[53]、黄体酮减少[54]。大鼠睾丸间质细胞和支持细胞对精子发生和激素合成有重要作用，可一定程度上反映药物的生殖毒性。10 μmol/L的TP作用48 h抑制50%左右的大鼠睾丸支持细胞的细胞活力[55]。而对于大鼠睾丸间质细胞，TP在60 nmol/L浓度下作用24 h抑制30%的细胞活力[56]。林元藻等[57]用TP 30 μg/(kg·d)对Wistar雄性大鼠进行灌胃，12 d后处死，发现TP会降低精子质量。SD大鼠口服TP 0.1 mg/(kg·d)持续63～70 d导致大鼠生殖不育[58]。张俊鹏等[59]研究发现TP抑制睾丸支持细胞及管周细胞中的雄激素受体的表达。

除肝脏、肾脏和生殖系统外，TP对于其他细胞均有一定程度的毒性作用，如：大鼠主动脉平滑肌细胞[60]、大鼠气道平滑肌细胞[61]、大鼠心肌细胞等[62]。

截至目前，TP诱发的毒性作用机制及临床特征并不十分清楚。总体来说，体外细胞毒实验显示TP对正常细胞产生毒性的起始剂量在100 nmol/L左右，而体内动物实验也表明TP的安全剂量很低。TP发挥抗肿瘤作用是通过RNA聚合酶Ⅱ导致的全转录组抑制及其驱动的细胞凋亡，同时也可能是产生毒性的核心因素。其起效剂量与中毒剂量非常接近，甚至发生重叠，从而引起不可避免的毒副作用。

3 中药配伍减毒

为高效发挥TP抗肿瘤作用，同时降低其对机体脏器的毒性，国内外研究者做了大量研究和尝试：包括从结构修饰、配体偶联、药物制剂等手段对雷公藤甲素进行改造提高TP肿瘤靶向性并降低毒副作用[63]。而中药临床遣方用药常与其他单味药物进行配伍以增效减毒，以中药配伍理论为指导的临床实践，为现代医药学改善药物的疗效提供启示。见表2。

表2 中药配伍雷公藤甲素减毒机制

3.1 中药配伍降肝毒

TP引起的肝损伤以肝实质细胞的毒性为主，表现为肝功能生化指标ALT、AST明显升高；氧化应激水平升高；肝细胞变性坏死；P450酶活性降低导致肝脏代谢能力改变、解毒功能下降等。《神农本草经》记载白芍归肝、脾经，现代药理研究表明白芍具有护肝和调节免疫的作用。芍药苷配伍TP可降低TP对人正常肝脏细胞系L-02的毒性作用，增加超氧化物歧化酶的含量提高细胞的抗氧化应激能力，减少对细胞的损伤[64-65]。

药物在体内组织分布情况严重影响药物发挥药效以及毒性发生。Mei等[66]研究发现，大鼠TP给药15 min后各组织中TP浓度最高，其中肝脏中含量最高。肝脏是人体的主要药物代谢器官，TP在人肝脏中的代谢主要由CYP3A介导[67-68]。因此通过影响CYP3A的水平可以调节TP在体内的代谢，达到降低TP毒性的目的。Li等[67]发现用CYP3A激动剂地塞米松(100 mg/kg连续4 d)预处理雄性Wistar大鼠，可通过加速代谢，显著降低TP诱导的肝毒性。甘草是方剂具有代表性的使药，具有调和诸药、解毒等作用，其中最主要有效成分为甘草酸。淡墨等发现甘草酸通过升高CYP3A活性加速TP在体内的代谢，降低TP的肝毒性[69]。周学平等[70]报道了清络通痹方中三七、生地配伍TP使其Cmax下降，T1/2延长，在肝脏中的分布下降，从而起到了控释和缓释调节作用。此外，雷公藤配伍凤尾草[71]、槲皮素[72]、莫诺苷[73]等可提高抗氧化应激能力，减轻TP诱导的肝损伤。

3.2 中药配伍降肾毒

TP可引起肾脏毒性，表现为尿量减少，血尿、蛋白尿等肾炎综合征症状，肾功能指标血肌酐、尿素氮的含量明显升高。雷公藤多苷联合黄芪汤可有效缓解糖尿病肾病的临床症状，实验组治疗后尿蛋白、血肌酐和尿素氮等肾脏功能的指标均优于对照组[74]。白芍总苷通过下调转化生长因子-β(TGF-β)蛋白表达，降低肾脏毒性。刘蒙竹等[75]研究治疗类风湿关节炎清络通痹全方中，三七能明显降低TP的溶出，减低其对肾脏的毒性。此外，一些中药复方如益肾清利方、通络解毒方、健脾益肾方、固肾汤、六味地黄汤等配伍TP均能改善肾脏功能，降低肾毒性。

3.3 中药配伍降生殖毒性

除肝脏、肾脏外，TP也在生殖系统组织分布较多。其常引起生殖毒性，导致男性患者精液中精子活性和浓度下降，女性患者闭经、卵巢早衰等。张杰等[76]研究发现，紫云英苷可以有效逆转TP造成的小鼠睾丸指数下降，修复睾丸组织形态的损伤。阮秦莉等[77]发现，补肾活血汤可以通过抑制粗线期细胞凋亡，增加终变期卵母细胞数目改善TP导致的线虫卵巢功能下降，提高其生育能力。

4 讨论

天然活性物质是新药研发的重要来源，在癌症领域，利用天然产物或其衍生物开发的小分子化合物在新药研发中占比高至64.9%。雷公藤甲素作为中药雷公藤活性成分中最具代表性的三环氧二萜，具有广谱的抗肿瘤活性，通过调控细胞周期、细胞凋亡与自噬、细胞侵袭与转移、介导肿瘤免疫等方式来发挥抗肿瘤作用。雷公藤甲素广谱的抗肿瘤活性提示其靶向多种癌症发生发展过程中的关键分子及事件，为TFHⅡ转录复合体XPB的ATPase活性的抑制提供了一种可能性，即：雷公藤甲素是否通过影响细胞转录水平的整体调控从而介导多种信号通路的抑制作用？这仍然需要通过大量的科学研究进一步证实。

雷公藤抗癌活性成分雷公藤甲素亦是主要毒性成分，起效剂量与毒性剂量相接近导致雷公藤甲素安全窗口较窄，使其开发止于临床阶段。体外研究报道雷公藤甲素对AML细胞系较其他血液系统肿瘤以及实体瘤细胞系较敏感，在不影响正常细胞活力的浓度下即可抑制AML细胞系的活力。因此，寻找雷公藤甲素的敏感瘤谱是拓宽其安全窗口的手段之一。

除此之外，基于中医药理论的配伍减毒也是改善其治疗窗的潜在方法。通过建立合适的筛选手段与评价指标，筛选出抗肿瘤作用减毒增效的最佳配伍，调其偏性，制其毒性；同时致力于配伍减毒增效分子机制的研究，并将中医药理论体系与现代药理学手段结合，寻找能使雷公藤甲素增效减毒的配伍方法，或许可以成为雷公藤甲素在抗肿瘤方面临床转化的关键。