一株石油降解菌Aquabacterium olei NBRC 110486的基因组完成图及分析

唐标，常江，肖兴宁，吴静，钱鸣蓉，杨华

(1.浙江省农业科学院a农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，b 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021；2.上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240)

Aquabacterium归属于丛毛单胞菌科，伯克氏菌目，β-变形杆菌纲[1]。目前，已经有9个种的报道，分别是Aquabacteriumcitratiphilum、Aquabacteriumcommune、Aquabacteriumparvum、Aquabacteriumfontiphilum、Aquabacteriumlimnoticum、Aquabacteriumolei、Aquabacteriumtepidiphilum、Aquabacteriumlacunae、Aquabacteriumpictum(https://lpsn.dsmz.de/ genus/aquabacterium)。菌株Aquabacteriumcitratiphilum、Aquabacteriumcommune和Aquabacteriumparvum于2009年首次从德国的饮用水系统中分离[1]，后又分别在2009和2012年从我国台湾地区温泉中分离了A.fontiphilum[2]、A.limnoticum[3]。随后，2019年在西藏的温泉沉积物中分离到了A.tepidiphilum[4]。2020年，我国台湾地区淡水池中又分离到A.lacunae[5]；另外，在日本多摩河的生物膜中分离出来A.pictum[6]。以上8株菌都从水环境中分离到，而A.oleiNBRC 110486是2015年从韩国境内被石油污染的土壤中分离获得，并且能够利用汽油、柴油和煤油作为碳源生长，具有作为生物修复菌株的潜力[7]。关于能够降解石油的细菌的报道很多，如Rhodococcus[8]、Pseudomonas[9]等。链烷1-单加氧酶AlkB是细菌降解烷烃的关键酶，也是最普遍存在的类型[10-11]。菌株NBRC 110486是Aquabacterium属中首个报道可以降解石油的菌，但是其完整的基因组没有测序，序列特征也尚未阐述。

本研究首次报道了Aquabacterium属的完整基因组序列，对基因组特征、基因簇预测和降解基因进行了分析，可以作为该属的参考序列为后续研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 菌株培养与基因组DNA抽提

A.oleiNBRC 110486购买于国际保藏中心NBRC(NITE biological resource center)。菌株接种至保藏中心推荐的R2A琼脂培养基(Bacto Yeast Extract 0.5 g；Bacto Proteose Peptone No.3 0.5 g；Bacto Casamino Acids 0.5 g；Glucose 0.5 g；Soluble starch 0.5 g；Sodium pyruvate 0.3 g；K2HPO40.3 g；MgSO4·7H2O 0.05 g；Agar 15 g；Distilled water 1 L；pH 7.2±0.2)，在28 ℃活化培养3 d，随后转接至R2A液体培养基于28 ℃、200 r·min-1培养2 d。收集菌体，使用QIAGEN细菌基因组提取试剂盒，按照说明书提取基因组DNA。

1.2 基因组测序、组装及注释

细菌基因组DNA提取后，在浓度和纯度达标的基础上，构建20 Kb片段文库，使用第三代测序仪PacBio RS Ⅱ进行高通量测序。原始数据去除低质量的数据后，采用Celera Assembler软件进行组装[12]，利用Quiver对组装结果进行优化。使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline[13]对其进行基因预测及功能注释。

1.3 基因组圈图绘制和基因簇预测

基因组注释圈图使用CGView server[14]进行绘制，使用antiSMASH v5.2[15]对次级代谢产物合成基因簇进行预测分析。

1.4 系统发育分析

链烷1-单加氧酶AlkB使用Long等[16]报道的序列作为参考，与该基因组进行比对，匹配该蛋白。通过在NCBI数据库上BLAST检索直系同源蛋白，选择同源性大于30%的蛋白序列，并去除部分冗余蛋白序列。使用MUSCLE软件进行对位比对，使用MEGAX软件[17]基于最大似然法(Maximum-likelihood method)构建系统发育树，进化树分支模式的稳定性分析采用bootstrap法，重复次数为1 000。

2 结果与分析

2.1 基因组完成图信息

测序获得菌株NBRC 110486的完成图，包括1个环形染色体和1个环形质粒pTB101(图1)。从染色体的GCskew图中可以看出，序列能够清晰的分成2个部分，说明了组装结果的可靠性[18]。染色体全长3 890 087 bp，GC含量为67.33%，共3 402个蛋白；质粒大小为366 221 bp，GC含量为66.91%，325个蛋白。染色体上的蛋白平均长度为1 056 bp，编码序列占整个基因组序列长度的92.3%。染色体上包含4个连续的核糖体rRNA操纵子(274 725 bp～297 079 bp)和共计60个tRNAs(表1)。

图1 菌株NBRC 110486的基因组圈

表1 菌株NBRC 110486的完成图基本信息

2.2 次级代谢基因簇

通过数据库预测到2个可能的次级代谢合成基因簇，第一个是β-丙内酯相关基因簇mmdA-caiA(494 394 bp～501 271 bp)；另一个是萜类合成相关基因簇lon-pssA(2 253 380 bp～2 271 318 bp)，其中HpnD(鲨烯合酶)是该类基因簇的关键合成酶[19]。基因簇mmdA-caiA共5个保守基因，与MarinobacteroulmenensisDSM 22359和PseudomonasoleovoransE1 205具有同源性。而lon-pssA包含12个保守基因，与A.communeDSM 11901、SchlegelellathermodepolymeransDSM 15344、PaucibactertoxinivoransDSM 16998、Burkholderialesbacterium JOSHI_001、Pelomonassp. Root662基因组的核酸同源性>75%(图2)。

图2 菌株NBRC 110486的基因簇

2.3 AlkB蛋白的系统发育分析

对菌株NBRC 110486中的AlkB蛋白同源性大于30%的直系同源蛋白进行了聚类分析，共使用了143条蛋白序列，获得67个明确分类的属，其中Burkholderia、Pseudomonas、Marinimicrobia等属中包含的物种较多。系统发育图中聚类了3个较明显的大分支A、B和C(图3)。另外，在数据库中共发现了7个Aquabacterium属的AlkB蛋白，但是它们分别聚类在不同的分支上。A.fontiphilum、A.parvum、Aquabacteriumsp. NJ1在分支A上，且与一株Burkholderiales目的细菌(RTL27502)亲缘关系最近。而Aquabacteriumsp. NBRC 110486、Aquabacteriumsp. KMB7、A.commune和Aquabacteriumsp(WP_125245606.1)位于C分支上，从进化的角度上看与假单胞菌属(Pseudomonas)更接近。结果表明，AlkB蛋白在细菌中分布较广泛，且多样性高。

图3 AlkB蛋白的系统发育分析

3 小结与讨论

尽管很多细菌已经有高通量测序数据，由于三代测序仍存在较高的成本，能够获得完整基因组(完成图)的细菌仍占很小的比例。自Aquabacterium属在1999年被报道以来，该属已有9个种被鉴定，其中6株菌有全基因组序列尚且是草图，所以此次报道菌株A.oleiNBRC 110486的完成图对该属具有重要的参考价值。本文仅预测到2个可能的基因簇，说明该菌株生产次级代谢产物的能力较弱。测序获得了该属的第一个质粒pTB101序列，GC含量与染色体类似，说明是长期共进化的结果，水平转移获得的可能性较小。该质粒序列的公布，有利于未来开发Aquabacterium属的遗传操作系统。

AlkB蛋白可作为环境中检测石油降解菌的分子标记[20]。本研究不仅在菌株NBRC 110486中发现了AlkB蛋白，还在数据库中挖掘到该属其他6个同源蛋白序列，意味着该属其他菌也有降解石油的潜力，但是需要通过实验证实。进一步从系统发育分析中可以看出，它们是属于2个不同的来源，这也说明了AlkB蛋白具有较高的分布多样性[11]。

总的来说，该研究首次报道了Aquabacterium属的完整基因组序列，可以为该属的遗传改造和石油污染生物修复功能的后续研究提供重要依据。