GeneXpert MTB/RIF Ultra检测胃液标本对儿童肺结核的诊断价值

方敏 石艳 段莉 石小梅 全舒婷 王亚翠 彭小姗 郏继航 綦辉 焦伟伟 朱渝 孙琳

世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2020年全球结核病报告显示，2019年全球儿童结核病患者约120万例[1]。由于结核病患儿检测标本采集困难、细菌载量低，难以获得有效的实验室证据，致早期快速诊断成为目前儿童结核病防控面临的主要问题。因此，亟需建立更为敏感的检测方法和技术，以提升儿童结核病的检出率，及早有效管理。

分子生物学方法可以直接检测标本中病原体核酸，具有较高的敏感度，可明显提高结核病的诊断效率，已被《WS 288—2017肺结核诊断》[2]作为结核病确诊的方法之一。超敏结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测(GeneXpert MTB/RIF Ultra，简称“Xpert Ultra”)方法在成年人结核病诊断中表现出了较高的敏感度，能够更快地为临床提供早期诊断依据[3-6]，具有非常好的临床应用前景。但其目前在儿童结核病诊断中的应用数据较少，这在一定程度上阻碍了其在临床上的推广。目前，用于结核病分子生物学诊断的标本类型多以呼吸道标本为主，包括咳出痰、诱导痰、鼻咽拭子和支气管灌洗液等[7-10]，而对其他类型标本的研究数据尚少。胃液是检测儿童患者病原学的重要标本类型，而应用Xpert Ultra检测儿童结核病患者胃液的效能评价仍然较少。因此，笔者选取儿童肺结核患者和其他呼吸系统感染性疾病患者的胃液标本，应用Xpert Ultra进行检测，以评价该技术对儿童肺结核的诊断效能。

对象和方法

1.研究对象：采用回顾性研究方法选取2019年7月至2020年7月就诊于四川省凉山彝族自治州第一人民医院儿科且符合入组标准的173例患儿作为研究对象，年龄范围为0.3～14岁，中位数(四分位数)为8.0(4.0，11.0)岁；男84例(48.6%)，女89例(51.4%)。仅16例(9.3%)能够提供明确的卡介苗接种史证据，86例(49.7%)接种史不明，71例(41.0%)无接种史。研究对象中，经临床综合诊断为活动性肺结核患儿114例(观察组)，其他呼吸系统感染性疾病患儿59例(对照组)。观察组中，胃液结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)培养(BACTEC MGIT 960液体培养，简称“MGIT 960液体培养”)阳性23例(20.2%)，阴性91例(79.8%)。91例培养阴性患儿中，有活动性结核病临床症状和体征，同时伴胸部影像学改变、结核菌素皮肤试验和γ-干扰素释放试验阳性者65例(57.0%)；有活动性结核病临床症状和体征，同时伴胸部影像学改变、结核菌素皮肤试验阳性者9例(7.9%)；有活动性结核病的临床症状和体征，同时伴胸部影像学改变、γ-干扰素释放试验阳性者17例(14.9%)。对照组中，支原体感染者32例(54.3%)，细菌性感染者15例(25.4%)，未查到明确病原体但常规抗感染治疗后病情好转或治愈者12例(20.3%)。

2.纳入标准：(1)观察组：所有患儿均评估活动性结核病相关临床症状和体征，并进行胃液抗酸染色、胃液MTB培养、胸部影像学检查、免疫学检查[结核菌素皮肤试验和(或)γ-干扰素释放试验]，如符合以下标准则诊断为活动性肺结核[11]：①涂片抗酸杆菌检测阳性或MTB培养阳性；②有活动性结核病的临床症状和体征，同时伴胸部影像学改变及免疫学检查(结核菌素皮肤试验或γ-干扰素释放试验)阳性；③经鉴别诊断排除其他肺部疾病。(2)对照组：经评估活动性结核病临床症状和体征，并进行胃液抗酸染色、胃液MTB培养、胸部影像学检查，均不提示活动性结核病；结合患儿存在的其他病原感染证据，以及常规抗感染治疗后病情好转或治愈的患儿。

3.排除标准：未行结核病相关检查；未行Xpert Ultra检测胃液；临床资料不完全。

4.样本采集：(1)胃液标本：患儿入院第2日晨起空腹采集。胃管经鼻进入胃中，采用注射器抽取2～8 ml胃液，分装后于-80 ℃保存。(2)痰液标本：患儿深吸气2～3次，每次用力呼出，咳出痰液标本于痰盒中，于-80 ℃保存。后续分别对两种标本进行MTB培养和Xpert Ultra检测。

5.Xpert Ultra检测：根据产品说明书进行操作。取胃液2 ml于无菌离心管中，加入NaOH溶液进行中和，直至NaOH终浓度为1.5%。充分振荡10～15 s后室温放置15 min，期间每5 min再充分振荡混匀1次。置于离心机中4000×g离心15 min。弃上清，离心管中加入2 ml处理液，将剩余的沉淀吹打混匀后加入检测盒中上机检测。取痰液1 ml加入2 ml处理液，充分振荡后室温放置15 min，取2 ml处理后的样本上机检测。当MTB DNA检测阳性时，依据MTB的Ct值间接反映所检测样本中MTB的菌载量，分为高、中、低、非常低、微量；同时对MTB菌株利福平耐药位点进行药物敏感性试验，结果分别为利福平耐药、敏感和不确定。

6.MGIT 960液体培养：取1～2 ml胃液或痰液置50 ml离心管，加入等量N-乙酰-L半胱氨酸碳酸氢钠(NaOH-NALC)前处理液振荡1 min后静置15～20 min。加磷酸缓冲盐溶液(PBS)至45 ml，置于离心机中3000×g4 ℃离心15 min。弃上清，加1 ml PBS混匀后进行MTB培养。

7.统计学处理：采用SPSS 23.0软件进行数据分析。计数资料采用“百分率(%)”表示，组间差异的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。以临床综合诊断为参照标准，评价Xpert Ultra 检测胃液标本对儿童肺结核的诊断效能，各指标计算公式如下：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%。各方法间的一致性检测采用Kappa检验，其中，Kappa≥0.75，说明两种方法诊断一致性较好；0.4≤Kappa<0.75，说明两种方法诊断一致性一般；Kappa<0.4，说明两种方法诊断一致性较差。

结 果

1.Xpert Ultra检测胃液标本的诊断价值：以临床综合诊断为参照标准，Xpert Ultra诊断儿童肺结核的敏感度为53.5%(61/114)。根据患儿的年龄分为学龄前患儿(0～6岁组)和学龄期患儿(6～14岁组)，分别为57例和116例。Xpert Ultra检测两组患儿胃液标本诊断肺结核的敏感度分别为66.7%(26/39)和46.7%(35/75)，前者敏感度明显高于后者，差异有统计学意义(χ2=4.126，P=0.042)。而MTB培养诊断儿童肺结核的敏感度为20.2%(23/114)。具体见表1。

2.Xpert Ultra检测胃液和痰液标本诊断价值的比较：研究对象中，仅65例采集到痰液标本，其中，观察组采集46例，对照组采集19例。以临床综合诊断为参照标准，Xpert Ultra检测胃液和痰液标本诊断儿童肺结核的敏感度分别为52.2%(24/46)和43.5%(20/46)，二者间差异无统计学意义(χ2=0.697，P=0.404)。具体见表2。

3.Xpert Ultra对胃液培养阳性标本菌载量的检测：在胃液标本MTB培养阳性的23例患儿中，21例(91.3%)经Xpert Ultra检测阳性，其菌载量分别为微量3例(14.3%)、极低载量4例(19.1%)、低载量10例(47.6%)、中等载量2例(9.5%)、高载量2例(9.5%)。在胃液MTB培养阴性的150例患儿中，40例经Xpert Ultra检测阳性，其菌载量结果分别为微量15例(37.5%)、极低载量7例(17.5%)、低载量14例(35.0%)、中等载量1例(2.5%)、高载量3例(7.5%)。

表2 Xpert Ultra以临床综合诊断为参照标准检测胃液和痰液标本对儿童肺结核的诊断效能

4.Xpert Ultra对儿童肺结核的耐药检测：Xpert Ultra检测胃液阳性的61例患儿中，18例(29.5%)为微量菌载量，无法判断其耐药结果；5例为利福平耐药，其中3例为MTB培养阳性，但仅1例获得 MGIT 960药物敏感性试验结果，且为异烟肼和利福平均耐药。

讨 论

2014年WHO颁布的《国家结核病规划关于儿童结核病处理指南(第2版)》强烈推荐GeneXpert MTB/RIF方法可用于儿童结核病的诊断[11]。然而，该方法对MTB低菌载量标本的检出率仍有待提高。随着敏感度明显提高的新一代Xpert Ultra方法的研发，其可将检出下限由原来的112.6 CFU/ml降为15.6 CFU/ml[12-13]，检出时间由GeneXpert MTB/RIF所需的112 min缩短至84 min。因此，Xpert Ultra在诊断儿童等少菌结核病患者中的应用价值更大。本研究结果显示，Xpert Ultra检测胃液对MTB培养阳性的结核病患儿的敏感度达到了91.3%。以临床综合诊断为参考标准，Xpert Ultra检测胃液对所有结核病患儿的敏感度也达到了53.5%，说明当传统细菌学方法难以获得MTB感染证据时，仍有相当比例的患儿可以通过Xpert Ultra 方法得以确诊。因此，采用高敏感度的分子生物学方法可以有效提高儿童结核病的确诊率。同时，该方法操作简单，采样1～2 h即可得到检测结果，这对于儿童结核病的早期诊断、早期治疗也具有重要作用。

由于儿童本身的特点，尤其是婴幼儿，往往难以取得合格的痰液标本。本研究纳入的173例患儿中，仅65例患儿可以采集到痰液标本。同时，婴幼儿也是结核病发病的高危人群，在其感染MTB后，很容易发展为重症结核病。因此，寻找更适合婴幼儿诊断的标本类型具有实际的临床应用价值。

胃液是儿童感染性疾病患者病原学检测的重要标本类型，特别是5岁以下儿童的呼吸道分泌物更多的被吞咽到胃里，尤其是经过一夜的睡眠，含MTB的分泌物在胃内富集，更容易检出MTB。另外，在一些咳痰困难的成年人患者中，胃液也被用于病原学的检测[14-15]。本研究结果显示，Xpert Ultra检测胃液中MTB的敏感度略高于痰液，说明Xpert Ultra对儿童肺结核具有较好的诊断价值。同时，Xpert Ultra检测学龄前患儿胃液标本诊断肺结核的敏感度明显高于学龄期患儿，提示Xpert Ultra对于学龄前患儿肺结核诊断的临床应用价值更高。一项德国的研究分析了2002—2010年间采用胃液标本确诊儿童肺结核的情况，结果显示59%的肺结核患儿可通过胃液标本检测得以确诊，且有34.7%的患儿只检测了胃液标本；同时，结果还显示小于1岁患儿的检出率最高，4岁以内患儿的检出率在68%左右，而10岁以上患儿的检出率只有37%，提示检测胃液的阳性率随年龄的增长而逐渐下降[16]，与本研究结果一致。

胃液的采集和保存方式也对检出率有一定影响。有研究对比分析了标准化胃液采集流程建立前后，结核病患儿胃液标本MTB培养的阳性率，尽管患者例数较少，但仍可认为严格的操作者培训、采集时间短、吸出物标本尽快中和并处理可有效提高病原学检出率[17]。标本的储存时间是否会影响胃液标本的MTB检出率也存在不一致的结论。例如，Singh等[18]检测冷冻储存650～849 d内胃液标本的MTB阳性率为77.1%，而超过1050 d后的检测阳性率则降至50%，说明随着胃液标本储存时间的延长，Xpert检测的阳性率也下降；但该研究也发现，即使检测冷冻存放4年以上的胃液标本，其检出率也可以达到50%。此外，胃液采集需患儿严格禁食至少4 h，故最好晨起空腹取胃液，以避免食物残渣对检测结果的影响。

随着近年来耐药细菌的流行，耐多药结核病和利福平耐药结核病的患者数居高不下。由于Xpert Ultra方法可以同时检出利福平耐药，因此，其在儿童耐药结核病的早期快速诊断也具有很好的应用价值。而传统药物敏感性试验需要在获得细菌菌株后才能进行，往往需要1个月以上的时间，远滞后于临床需求。本研究中，61例Xpert Ultra检测阳性患儿中，5例检测出利福平耐药，但仅1例获得了MGIT 960药物敏感性试验结果，且与Xpert Ultra检测耐药结果一致。这提示Xpert Ultra 检测有助于临床医师快速获得患儿利福平耐药结果，为及时选择合适的抗结核药品提供了依据。

综上，Xpert Ultra检测胃液标本对儿童肺结核诊断具有较好的敏感度和特异度，有助于儿童结核病的早期诊断。对于无法咳痰或者难以取得痰液标本的学龄前患儿来说，胃液标本是很有价值的替代标本类型。