烟草贮藏过程中包装方式对TSNAs形成的影响

张梦玥，刘德水，王俊,3，赵园园，周骏，马雁军，鲁喜梅，史宏志*

1 河南农业大学烟草学院/烟草农业减害研究中心，郑州 450002；

2 上海烟草集团北京卷烟厂有限公司，北京 100024；

3 郑州大学，郑州 450002

烟草贮藏是烟叶加工利用的重要环节，调制后的烟叶必须经过2年左右的贮藏和陈化才能被用于卷烟生产[1-3]。烟叶在贮藏过程中，多糖、色素、蛋白质、萜醇等大分子香气前体物质在酶或非酶作用下进一步降解转化，形成对香味品质有利的成分，杂气和刺激性降低，余味改善，质量提升。但另一方面，在烟叶贮藏过程中一些有害成分也不断形成和积累[4-5]。烟叶中的硝态氮可在贮藏温度较高时产生挥发性的氮氧化物，并与生物碱发生亚硝化反应生成烟草特有亚硝胺（Tobacco-Specific Nitrosamines，TSNAs）。烟草特有亚硝胺是存在于烟草、烟草制品及烟气中一类有害物质[6-8]，NNN和NNK对啮齿动物具有强致癌性，可诱发小鼠、大鼠等的肺癌和腺癌，其中NNK导致肺癌的活性最强[9-12]。2007年，NNN和NNK被国际癌症研究署（IARC）列为Ⅰ类致癌物[13]。据报道NNK可使动物和人体组织中的DNA出现甲基化，引发肿瘤的可能性增大[14-15]。迄今为止，已分离鉴定出的TSNAs共有8种[16]，目前研究较深入的主要有NNN、NAT、NNK和NAB，一般来说，TSNAs在烟叶成熟前和新鲜烟叶中含量极低，其形成和积累主要在烟草调制、贮藏和燃吸过程中[8-9,16-17]。TSNAs的直接前体物是生物碱和亚硝酸，烟叶生物碱的含量和组成及硝酸盐含量与TSNAs的形成密切相关[18-20]。在烟叶调制过程中，叶面微生物可把烟叶中的硝态氮还原成亚硝酸，进而发生亚硝化反应[21-22]。调制中的烟叶暴露于微量的NOx即可生成TSNAs[23-24]；烤烟明火烘烤过程中，燃料燃烧能够产生一定浓度的燃烧副产物NOx，明显地促进烟叶烘烤过程中TSNAs的形成[25]。烟叶贮藏过程也是TSNAs形成的主要时期，Shi等研究得出，在自然贮藏条件下，白肋烟和晒烟中TSNAs含量在1年内显著增加，两种类型烟叶总TSNAs含量均增加了215%左右，上升最快的时期是高温季节[26-28]。王俊等[28]通过使烟叶与硝酸盐/亚硝酸盐隔离共处后，测定样品的TSNAs含量及周围环境的NOx含量以及通过15N元素示踪实验得出了烟草在贮藏过程中TSNAs的生成途径为NO3-N和NO2-N在高温环境下产生氮氧化物（NOx），进而与生物碱反应形成TSNAs；烟叶生物碱亚硝化生成TSNAs的反应为氧化还原反应[29,25]，在贮藏袋中充入臭氧可大幅度提高TSNAs含量，综上所述，去除贮藏环境中的氧化剂和气态氮氧化物（NOx）有利于抑制TSNAs的形成[30-31]。

烟叶由叶片和烟梗两部分组成，除叶片外，烟梗也是卷烟配方的主要原料之一，梗丝在卷烟配方中占比为8%～30%[32]。烟叶的叶片和烟梗在化学组成上差异很大，一般而言，叶片生物碱和香气物质含量显著高于叶梗，但烟梗的硝态氮含量显著高于叶片[33-34]，在烟叶贮藏过程中烟梗TSNAs含量增加显著，因此探究贮藏过程中烟叶和烟梗TSNAs的形成和抑制技术很有必要。虽然烟叶贮藏一般2～3年较为有利，但在实际生产中，由于库存压力等各种原因，烟叶实际贮藏时间可达5年以上，以往有关烟叶贮藏研究多基于短期贮藏试验，关于抑制TSNAs形成的技术也局限于温湿度的控制[35-37]。本研究以烤烟、白肋烟和雪茄烟叶为材料，探索了真空包装等不同贮藏方式对降低烟叶叶片和烟梗贮藏过程中TSNAs形成的效果，旨在为优质低害烟叶和卷烟生产提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所用白肋烟品种为TN86（产自湖北省恩施市烟草公司）、烤烟品种为中烟100（产自河南省许昌市烟草公司）、雪茄茄芯烟叶品种为什烟1号（四川省德阳市烟草公司）以及雪茄茄衣品种为德雪3号（四川省德阳市烟草公司）。将样品叶片和烟梗分离，叶片切成0.5 cm2大小的碎片，烟梗切成长0.5 cm左右混匀备用。置于4℃储存待用。

1.2 试验方法

1.2.1 包装方式对常温条件下烟叶TNSAs及中性致香成分含量的影响

称取400 g的白肋烟样品3份，分别采用塑料袋包装、纸箱包装、真空包装袋抽真空处理后包装，（真空时间17 s，充气时间10 s，封口时间2 s，冷却时间1.5 s，封口温度中温，真空度：0.085 Mpa）将3份样品存放在实验室的自然环境下贮藏一年，另一份样品4℃低温保存作为对照。处理结束后，测定烟叶TSNAs含量和中性香气成分。

1.2.2 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗TNSAs含量的影响

分别称取50 g不同类型烟叶的叶片、烟梗（主脉）4份，取两份样品，其中一份采用真空包装袋包装并进行抽真空处理，另一份使用纸箱包装作为常规包装均放入恒温恒湿箱内于45℃下处理15 d，其余两份样品，一份于常温下使用纸箱包装作为常规包装处理15 d，另一份样品4℃低温保存作为贮藏前样品对照，取出后分别进行冷冻干燥磨碎，磨碎后过250 μm筛，测定处理前后TNSAs变化，每个处理设置3次重复。

1.3 化学成分测定

1.3.1 TSNAs含量测定

样品均由上海烟草集团北京卷烟厂进行测定。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPE-LCMS/MS） 法（SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis(Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。称取1.0 g烟样，将其放入50 mL锥形瓶中，加入40 μL 4种氘代TSNAs（内标）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸铵水溶液，在室温下用振荡器（200 r/min）萃取1小时，萃取液过0.45 μm水相滤膜后使用LC-MS/MS检测TSNAs含量[19]。NNN、NNK、NAT和NAB含量之和即为TSNA总量。

1.3.2 中性致香成分测定

采用同时蒸馏萃取仪提取香气物质，气质联用仪进 行 分 析（GC/MS：Agilent 7890A-5975C，Agilent Technologies，USA），内标法（硝基苯）进行测定。称20.000 g烟样放入100 mL圆底烧瓶中，依次加入2.0 g柠檬酸、0.5 mL内标和500 mL去离子水，充分摇匀。以40 mL的二氯甲烷为萃取剂，采用同时蒸馏萃取的方法收集有机相，并将样品浓缩至1 mL左右，备用。样品由GC/MS鉴定结果和NIST08库检索定性[38]。

1.4 数据分析

采用Excel 2007进行基础数据处理和绘图、SPSS 20.0进行方差分析，分析不同包装方式烟叶TSNAs、中性致香成分差异以及不同温度、不同类型烟叶处理后叶片和烟梗TSNAs差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 包装方式对常温条件下烟叶TSNAs及中性致香成分含量的影响

2.1.1 包装方式对常温条件下烟叶TNSAs的影响

白肋烟烟叶采用不同包装方式常温条件下贮藏一年后，TSNAs含量的变化见图1。与贮藏前相比，贮藏后样品TSNAs的含量均有所增加，塑料袋包装的样品4种TSNA的含量与对照相比显著增加（P＜0.05），TSNAs总量增加了128.72%，其中NNN和NNK含量分别增加了139.02%和119.85%；纸箱包装的样品TSNAs含量与塑料袋包装的无显著的差异（P＞0.05）。真空包装处理的烟叶TSNAs增加幅度最小，TSNAs总量与对照相比提高了23.56%，NNN和NNK含量仅增加了17.67%和29.65%，差异不显著（P＞0.05）；与纸箱包装贮藏的烟叶相比，TSNAs总量降低了45.4%，NNN和NNK含量分别减少了46.3%和34.7%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。研究结果表明，在常温贮藏过程中，与塑料袋包装、纸箱包装相比，采用真空包装处理能更好地抑制TSNAs的形成和积累。

图1 包装方式对白肋烟TSNAs形成的影响 (ng/g)Fig. 1 Effect of packaging method on TSNAs formation of burley tobacco

2.1.2 贮藏方式对常温条件下烟叶中性香气成分的影响

不同贮藏方式烟叶的中性香气成分含量如表1所示，经过一年的贮藏后，贮藏方式不同中性香气物质含量差异较大，其中真空包装处理的烟叶总香气含量最高为632.9 μg/g，显著高于其它处理（P＜0.05），塑料包装的香气物质总量次之，为563.77 μg/g，而纸箱包装的烟叶香气物质含量最低，为547.75 μg/g。贮藏方式不同，5类中性香气物质的含量各不相同，其中真空包装烟叶的类胡萝卜素降解物类、类西柏烷类、苯丙氨酸类、新植二烯含量最高。由此可见，烟叶采用真空包装在一定程度上可抑制TSNAs的形成和积累，且烟叶香气品质较好。

表1 不同包装方式的白肋烟中性香气成分的变化Tab. 1 Changes of neutral aroma constituents in burley tobacco under different packaging methods

2.2 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗TSNAs含量的影响

2.2.1 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NNN含量的影响

将不同类型烟叶常规包装（纸箱包装）和真空包装的叶片和烟梗样品分别在高温条件下贮藏15 d后测定NNN含量（图2），结果表明，4种类型经常规包装的烟叶样品在高温贮藏后NNN含量显著增加（P＜0.05），真空包装样品NNN含量增加幅度显著降低（P＜0.05），其中雪茄茄芯、茄衣、烤烟和白肋烟叶片NNN含量与常规包装样品相比分别降低39.27%、29.03%、17.62%、29.55%，烟梗NNN含量分别降低50.75%、28.94%、50.43%、32.29%，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。真空包装样品高温贮藏后的NNN的含量一般接近常温条件下常规包装的含量。从图中可知，烤烟叶片中NNN含量高于烟梗，雪茄茄芯、雪茄茄衣和白肋烟内两部分含量呈现相反趋势，贮藏前烤烟叶片中NNN含量是烟梗的14.70倍。雪茄茄芯叶片中NNN含量最高，且高于雪茄茄衣和烤烟叶片内NNN含量，烟梗内NNN含量大小排序为雪茄茄芯＞雪茄茄衣＞白肋烟＞烤烟。

图2 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NNN含量的影响Fig. 2 Effect of vacuum packaging on NNN content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.2 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NAT含量的影响

不同类型烟叶叶片和烟梗NAT含量的测定结果表明（图3），4种类型烟叶在高温环境下经真空包装后NAT含量均较常规包装（纸箱包装）有所降低，雪茄茄衣烟梗经真空包装后效果更显著（P＜0.05），较常规包装降低53.78%，雪茄茄芯、白肋烟、烤烟烟梗分别较高温常规包装下降35.00%、33.33%、13.90%。叶片以白肋烟经真空包装后NAT含量下降幅度更大，较常规包装下降44.10%，达显著水平（P＜0.05）。雪茄茄衣、烤烟和雪茄茄芯叶片经真空包装后较常规包装分别下降15.01%、24.24%、42.31%，且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。烟梗中NAT含量存在差异，白肋烟烟梗中NAT含量最高，其次是雪茄茄芯，烤烟烟梗中NAT含量最低。不同类型烟叶叶片和烟梗中NAT含量高低有所差异，贮藏前烤烟叶片中NAT含量高于烟梗中NAT含量，高温贮藏后烤烟烟梗中NAT含量增加幅度较大，造成烟梗中NAT含量高于叶片。雪茄茄芯、雪茄茄衣、白肋烟烟梗中NAT含量显著高于叶片；高温贮藏后的雪茄茄衣烟梗、白肋烟叶片内NAT含量增加幅度较大。

图3 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NAT含量的影响Fig. 3 Effect of vacuum packaging on NAT content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.3 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NNK含量的影响

测定不同类型烟叶样品的叶片和烟梗NNK含量如图4所示，4种类型烟叶抽真空处理后NNK含量均有所降低，且下降幅度均达到显著水平（P＜0.05），白肋烟降低幅度较大，叶片和烟梗经真空包装后NNK含量较常规包装（纸箱包装）显著降低45.05%和50.19%（P＜0.05），雪茄茄衣叶片和雪茄茄芯、烤烟烟梗经真空包装后较常规包装分别下降52.61%、56.72%、52.65%，下降率达50%以上，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。烤烟烟梗中NNK含量低于叶片中NNK含量，雪茄茄芯、雪茄茄衣、白肋烟叶片NNK含量高于烟梗，贮藏前，雪茄茄衣烟梗内NNK含量为叶片的6.88倍。雪茄茄衣烟梗中NNK含量最高，其次是雪茄茄芯，两者显著高于其他两种烟叶，烤烟中NNK含量最低。高温贮藏后的烟叶样品内NNK含量升高效果较常温贮藏更加显著。

图4 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NNK含量的影响Fig. 4 Effect of vacuum packaging on NNK content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.4 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NAB含量的影响

测定不同类型烟叶叶片和烟梗贮藏15 d后NAB含量如图5，从图中可以看出不同类型烟叶在高温环境下使用真空包装与常规包装（纸箱包装）后，叶片和烟梗内NAB含量的差异均达到显著水平（P＜0.05），且使用真空包装后NAB含量的下降程度有所不同，雪茄茄衣的叶片进行抽真空后NAB含量较高温贮藏下降64.72%，下降效果最显著（P＜0.05），其次是白肋烟和雪茄茄芯烟梗，与常规包装贮藏的烟叶相比分别降低了58.21%和57.63%，且差异均具有统计学意义（P＜0.05）；四种类型烟叶叶片和烟梗经真空包装后NAB含量与常温贮藏后NAB含量差异均未达到显著水平（P＞0.05）。在两种不同温度贮藏条件下NAB含量增加情况存在差异，在高温环境下，4种烟叶内NAB含量均呈大幅度增加。白肋烟烟梗NAB含量最高，烤烟叶片和烟梗内NAB含量最低。雪茄茄衣、茄芯、白肋烟烟梗NAB含量显著高于叶片内NAB含量，烤烟则相反。

图5 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗NAB含量的影响Fig. 5 Effect of vacuum packaging on NAB content in leaves and stems of different types of tobacco samples

2.2.5 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗TSNAs总量的影响

将不同类型烟叶常规包装（纸箱包装）和真空包装的叶片和烟梗样品分别在高温条件下贮藏15 d后测定TSNAs总量（图6），不同类型烟叶的叶片和烟梗在经过真空包装后，TSNAs总量较常规包装得到了不同程度的降低，且下降程度均达到显著水平（P＜0.05），以雪茄茄芯烟梗下降幅度最大，较高温贮藏显著下降44.80%（P＜0.05），雪茄茄衣、烤烟和白肋烟烟梗TSNAs总量别较常规包装降低35.86%、38.29%、20.84%，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。烟叶叶片以白肋烟下降幅度最大，较常规包装高温贮藏显著降低40.65%（P＜0.05），雪茄茄芯、雪茄茄衣、烤烟叶片内TSNAs总量分别下降38.52%、28.57%、21.52%。不同类型烟叶内叶片和烟梗中TSNAs总量高低情况与NNN、NAB、NAT、NNK相似，雪茄茄衣、雪茄茄芯、白肋烟烟梗TSNAs总量高于叶片，烤烟叶片内TSNAs含量较高。4种烟叶样品烟梗TSNAs总量大小排列如下：白肋烟＞雪茄茄芯＞雪茄茄衣＞烤烟。不同类型烟叶样品TSNAs总量于高温贮藏后含量大幅度增加，与4种TSNA情况相似。

图6 真空包装对不同类型烟叶样品叶片和烟梗TSNAs含量的影响Fig. 6 Effect of vacuum packaging on TSNAs content in leaves and stems of different types of tobacco samples

3 讨论

烟草特有亚硝胺是烟叶中重要的特有的有害成分，在长期贮藏过程中烟草特有亚硝胺含量表现出持续增加的趋势，表明贮藏环节是TSNAs形成的主要时期之一，也是采取人工措施降低烟叶TSNAs积累的关键时期[39,27-28]。不同类型烟叶以及烟叶的叶片和烟梗之间TSNAs含量差异很大，这一方面体现在新调制后的烟叶TSNAs含量有差异，另一方面也体现在烟叶贮藏过程中TSNAs形成量的不同。不同类型烟叶相比，烤烟TSNAs含量较低，且在烟叶贮藏过程中增加幅度较小，这与其烟叶采用烘烤的方式进行调制和烟叶硝态氮含量较低有关[40,33]，白肋烟、雪茄烟采用自然条件下晾制的调制方法，调制时间长，且烟叶硝态氮含量高，因此调制后和贮藏后的烟叶TSNAs含量增加幅度较大。烟叶叶片和烟梗都可用于卷烟生产，二者在化学组成上差别较大，烟梗的硝态氮含量显著高于叶片，但生物碱含量却低于叶片[41,34]，这直接影响到贮藏前和贮藏过程中TSNAs的形成，其中烤烟叶片的TSNAs含量高于烟梗，但白肋烟和雪茄烟等晾晒烟则是烟梗的TSNAs含量显著高于叶片，这种差异性主要与调制方式有关，但无论是烤烟还是晾晒烟，在贮藏过程中TSNAs的增幅都表现为烟梗大于叶片，这可能主要是由于烟梗硝态氮含量远高于叶片所致，特别是在高温贮藏条件下，本实验室前期研究表明，高温促使硝态氮产生气态氮氧化物，进而与生物碱发生亚硝化反应是高温贮藏过程TSNAs形成的主要机理[28,35]。

前人研究表明，由生物碱发生亚硝化反应生成TSNAs的反应是一种氧化反应，需要氧的参与[29-31]，去除贮藏环境中的NOx和氧气可能会对抑制TSNAs的形成有一定的作用。该研究中，无论是在高温环境中还是常温的条件下，经过真空包装后贮藏的不同类型的烟叶叶片烟梗中TSNAs的含量显著低于未经真空包装的烟叶。经过一年贮藏后，经真空包装处理后贮藏的白肋烟叶与另外两种贮藏方式相比较，其TSNAs的增幅最小，由此可见烟叶真空状态在一定程度上可抑制TSNAs的生成，这可能与采用真空包装后有效地隔绝空气，减少空气的氧化作用有关。该研究为在烟叶贮藏阶段降低TSNAs的生成，进而提高烟叶及制品的安全性提供了新的思路和方法。

4 结论

烟叶和烟梗采用真空包装方式进行贮藏，可有效地隔绝空气，显著抑制TSNAs的形成和积累，TSNAs增加量显著低于未经真空包装的烟叶，且烟叶中性致香成分含量较高。因此在雪茄烟、白肋烟和烤烟烟叶和烟梗长期贮藏过程中，采用真空包装有利于减少有害物质的形成，提升优质低害烟叶原料保障水平。